Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Het gebruik van monsters van menselijke vrijwilligers volgde de protocollen die zijn goedgekeurd door het Scripps Research Institute Institutional Review Board. Voorafgaand aan de bloeddonatie werd geïnformeerde toestemming verkregen van de donoren. 1. bereiding van het reagens Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) Herstel perifere bloed mononucleaire cellen van normale menselijke donoren door Ficoll-plaque plus isolatie. Cryopreserve bij 50.000.000 cellen/mL in 90% foetaal runderserum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Vries de cellen bij-80 °C en breng over naar vloeibare stikstof voor lange termijn opslag. Labeling doel antigen peptiden voor het sorteren Genereren of verkrijgen van peptiden specifiek voor het doeleiwit (tot 70 residuen lang) met een terminale biotine. Etiket 4 nmol van elke individuele biotinyleerd peptide met streptavidine covalent gehecht aan PE (R-phycoerythrin) of APC (allophycocyanin) in afzonderlijke buisjes. Bereid met behulp van een molaire verhouding van 9:1 peptide aan streptavidine (SA), met een uiteindelijke concentratie van ongeveer 3,2 μM voor SA-PE en 5,7 μM SA-APC. Bereid Biotine tetramers als een negatieve controle. Inincuberen elke peptide mix ‘s nachts, in het donker, bij 4 °C met langzame menging. Verwijder ongebonden de door het gelabelde peptiden door te geven via micro kolommen die polyacrylamideparels bevatten. Bewaar peptide tetramers tot 2 maanden bij 4 °C. 2. sorteren van cellen Ten minste 1 h tot 16 h voor de CD22 + isolatie, ontdooien donor PBMCs en laten rusten bij 37 °C. Verwijder flacons met bevroren PBMCs uit de vriezer en breng onmiddellijk over in een waterbad van 37 °C. Wanneer de flacons bijna ontdooid zijn, gaat u over naar het werkgebied. Breng de inhoud van elke injectieflacon over in een buis van 50 mL met voorverwarmde medium (waarbij de donoren gescheiden blijven). Voeg medium toe aan een eindvolume van 50 mL. Meng de inhoud voorzichtig. Centrifugeer op 370 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg, regeer de cellen in 15 mL RPMI compleet medium en voer een celtelling uit. Pas de celconcentratie aan op 2,0 x 107 cellen/ml met het volledige rpmi-medium en breng cellen over in een T75 kolf of groter en incuberen bij 37 °c gedurende ten minste 1 uur en tot 16 uur om de hersteltijd voor ontdooide cellen toe te staan. Verzamel de cellen (pooling indien gewenst) en centrifugeer bij 370 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c. Gooi supernatant weg en regeer de cellen in 5 mL ijskoude MACS buffer (PBS, pH 7,6 met 0,5% BSA en 2 mM EDTA), breng naar 50 mL met MACS buffer en voer een aantal cellen uit. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 7 minuten bij 4 °c. Isoleer de CD22+ B-cellen door positieve selectie via Capture op CD22 microbeads. Gebruik MACS buffer voor alle washes. Tel en centrifugeer 400 x g gedurende 7 minuten bij 4 °c. Het verwachte herstel is 5-10% van de totale PBMC populatie. Respendeer cellen op 40.000.000 per mL FACS buffer (tris-buffer, pH 8,0 met 0,5% BSA en 2 mM EDTA) en ga verder met celkleuring van de donoren afzonderlijk of als een pool. Vlek cellen voor geheugen B-celsortering Verwijder een aliquot van cellen voor het instellen van de cytometer en de compensatie voor elk van de gebruikte fluophores. Niet-bevlekte cellen opnemen als een besturingselement. Bereken het uiteindelijke kleurings volume voor het aantal verkregen CD22+ cellen (kleuring 2.000.000 per 100 μL). Voeg extracellulaire markers toe voor B-cellen (CD19-PerCP-CY 5.5), IgG (IgG-FITC) en geheugen compartiment (CD27-PECy7) volgens de verdunnings aanbevelingen van de fabrikant en meng zachtjes. Aliquot 107 cellen in een tube van 1,5 ml voor de negatieve controle en breng de resterende cellen over naar een buis van 15 ml. Voeg de dubbele gelabelde biotin-SA-tetramers toe aan de negatieve controle buis bij een eindconcentratie van 36 nM per stuk voor PE en APC, vermenigvuldigd met het aantal peptiden in de sorteer buis en breng het volume naar 0,5 mL definitief met FACS-buffer (bijv. 10 peptiden x 36 nM = 360 nM). Voeg de peptide tetramers toe aan de sorteer buis bij 36 nM elk voor PE en APC en breng de cellen naar 2×106 per 100 ΜL met TBS-buffer. Inincuberen bij 4 °C in het donker en met zachte rotatie voor 30-60 min. Was 2x bij 4 °C, 400 x g, 7 min, verwijder een aliquot om te tellen voor de laatste wasbeurt. Filter cellen met 5 mL filterdop buizen. Voeg DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole) vlek tot 0,3 μM eindconcentratie net voorafgaand aan het sorteren als een marker van de integriteit van de celmembraan. Sorteren van één cel via Flowcytometrie Bereid 48 putten van 96-goed PCR-platen voor sortering. Bereid een hoofdmix voor: (2 μL van 10x RT-buffer, 0,5 μL RNase-remmer, 7,5 μL steriel water van PCR-niveau) per monster. Aliquot 10 μL per goed, afdekking en bewaren bij 4 °C tot het klaar is om te sorteren. Voer de negatieve controle op de celsorteerder uit, waarbij het hele voorbeeld wordt geanalyseerd. Stel flow cytometrie poorten in om de juiste celpopulaties te isoleren voor het sorteren van één cel. Plot FSC-gebied versus SSC-gebied en stel Gate R1 in om lymfocyten te isoleren. Plot FSC-hoogte versus FSC-breedte en stel Gate R3 in om FSC-doubleten uit te sluiten. Plot SSC-hoogte versus SSC-breedte en stel Gate R4 in om SSC-doubleten uit te sluiten. Plot SSC Height versus DAPI en stel Gate R5 in om levende cellen (DAPI-) te isoleren. Plot IgG VS CD19 en zet Gate R6 om IgG+ B cellen (CD19+ IgG+) te isoleren. Plot IgG versus CD27 en stel Gate R7 in om geheugen B-cellen (CD27hoog) te selecteren. Plot antigen-PE (AG-PE) vs antigeen-APC (AG-APC) en set Gate R8 als een AG-PE+/AG-APC+ Kwadrant met een laag aantal gebeurtenissen in de dubbele positieve poort. Verzamel een gelijk aantal geheugen cellen uit het antigeen-positieve (AG+) monster voor de bepaling van het signaal naar ruis. Sorteer enkelvoudige cellen met het fenotype CD19+ CD27+ AG-PE+ AG-APC+ (Gate R8) in bereide 96-well PCR-platen. Afdekplaten met aluminium tape pads, Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 400 x g en bewaar bij-80 °C voor toekomstig klonen. 3. klonen van één cel Omgekeerde transcriptie reacties Verwijder de enkelvoudige B-cel Sorteer plaat van 80 °C. Ontdooien op ijs gedurende 2 min. Draai de plaat gedurende 2 minuten bij 3.300 x g om de inhoud in de bodem van de putjes te openen voordat u deze opent. Bereid een dNTP/buffer Master mix met 10% niet-ionische reinigingsmiddel en oligo (dT) als de omgekeerde primer. Voeg enzym mix toe aan elk goed met de enkele cel en Meng niet. Inincuberen 5 min bij 65 °C. Voeg enzym Master mix met 100 mM DTT, RNase-remmer en reverse transcriptase enzym toe om het totale volume te brengen tot 20 μL. Inbroed 10 min bij 50 °C, dan 10 min bij 80 °C. Overdracht naar ijs voorafgaand aan het starten van PCR-stappen Meerdere stappen geneste PCR-reacties Gebruik afzonderlijke geneste PCR-reacties worden gebruikt voor de versterking van de zware keten (HC) en de lichte keten (LC). Gebruik voor de eerste ronde van PCR-versterking (stap I) een pool van voorwaartse primers en een enkele omgekeerde primer om de HC-en LC-variabele regio’s te versterken in afzonderlijke PCR-reacties (Figuur 2). Door het ontwerp zal de pool van voorwaartse primers een groot percentage van de kiembaan Leader (L)-sequenties versterken en de omgekeerde primer is specifiek voor de benedenstroomse constante gebieden van elke keten, inclusief zowel de Kappa (κ) als lambda (λ) voor licht kettingen16. Gebruik 2,5 μL cDNA-product als sjabloon voor elke PCR-(stap I)-reactie. Voeg primers toe aan de uiteindelijke reactie concentratie van 1 μM per stuk. Verdubbel de 10x polymerase buffer tot 2x de concentratie, breng het eindvolume naar 25 μL per reactie. Voer HC PCR-reacties uit met behulp van [94 °C/4 min; 94 °C/15 s, 55 °C/20 s, 68 °C/60 s; 68 °C/3 min] voor 50 cycli. Voer LC-PCR-reacties uit met [98 °C/4 min; 98 °C/15 s, 72 °C/20 s, 72 °C/60 s; 72 °C/3 min] voor 50 cycli. Gebruik 2,5 μL van het product Step I als template voor elke (stap II) PCR-reactie. Voeg de pool van voorwaartse primers toe die specifiek zijn voor de regio HC en LC (κ en λ) Framework 1 en een pool van reverse primers die specifiek zijn voor de Junction-regio van elke keten van antilichamen. Dubbele de 10x polymerase buffer tot 2x concentratie, en uitvoeren PCR reacties 50 cycli elk met behulp van dezelfde parameters als stap I. Voer de voltooide PCR-reacties uit op 1% agarose-gel om positieve versterkings treffers te visualiseren. Herstel gekoppelde amplicons (zowel zware als lichte keten uit dezelfde cel) en Isoleer via gel-extractie. Bepaal DNA-fragment concentratie via OD260 voor nauwkeurige ligatie mix berekeningen. Combineer herstelde zware en lichte ketting fragmenten met een linker fragment en de Expression vector backbone met behulp van een 4-fragment ligatie reactie met behulp van een commerciële Kit. Transformeer ligatie reacties in chemisch competente bacteriën met behulp van een commerciële Kit. Eenmaal geplateerd op antibiotica platen, Voeg 4 mL groeimedia (met antibioticum) toe aan de overgebleven transformatie cultuur en incuberen 37 °C ‘s nachts bij 250 rpm. Dit is de “ligatie mix cultuur.” Bereid miniprep DNA van de nachtelijke ligatie mix culturen met behulp van een commerciële Kit, en bepaal de resulterende plasmide DNA-concentratie. 4. ELISA-scherm voor bevestiging van antigeen-specificiteit Transfect 10 μg miniprep DNA met cationische lipide-gebaseerde reagens in 10 mL suspensie 293 cellen, en incuberen voor 3-4 dagen bij 37 °C (8% CO2) tijdens het roteren bij 125 rpm. Voor de oogst, centrifuge cultuur 10 min bij 1.000 x g en herstellen van geklaarde media. Meet de IgG-concentratie in de supernatanten via affiniteit met proteïne A. Test elke IgG (in supernatant) op 20 μg/mL door een enzym-gebonden adsorptietest (ELISA) tegen de individuele peptiden die voor het soort worden gebruikt, gevangen op een streptavidine-plaat of actine als een negatieve controle. Gebruik een geit anti-humaan peroxidase secundair antilichaam tegen menselijke IgG Fab om recombinant klonen te detecteren. Na het aftrekken van de achtergrond, wordt OD > 0,5 gedefinieerd als positief scherm. Bevestig de positieve hits van het scherm door een extra ELISA uit te voeren met verdunningen van IgG-supernatant om een concentratie curve te genereren vanaf 20 μg per mL, en om te plotten tegen OD voor elk antigeen dat reactiviteit weergeeft in het initiële scherm ELISA.