マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析
Summary
スプライセオソームsnRNAの生体発生は、様々な細胞コンパートメントを含む複雑なプロセスである。ここでは、細胞内での輸送を監視するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用しました。
Abstract
スプライセオソームsnRNAの生体発生は、核相と細胞質相の両方を含む複雑なプロセスであり、最後のステップはCajal体と呼ばれる核コンパートメントで起こる。しかし、この亜核構造にsnRNA局在化を指示する配列は、最近まで知られていなかった。カジャール体内のsnRNAの蓄積に重要な配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用し、その後細胞内での局在化を行った。まず、SnRNA欠失変異体、インビトロ転写用の合成DNAテンプレート、およびAlexa488と組み合わせたUTPの存在下で転写されたsnRNAを調製した。標識されたsnRNAをTRITCと共役した70kDa-Dextranと混合し、ヒトHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。細胞を1時間固定して固定し、カジャルボディマーカーコイルリンを間接免疫蛍光で可視化し、核または細胞質注射のマーカーとなるsnRNAとデキストランを蛍光顕微鏡で直接観察した。この方法は、様々な配列が細胞内のRNA局在化にどのように影響するかを効率的かつ迅速にテストすることを可能にします。ここでは、Cajal体内へのSnRNAの効率的なローカリゼーションのためのSm結合配列の重要性を示す。
Introduction
RNAスプライシングは、遺伝子発現における重要なステップの1つであり、スプライセオソームと呼ばれる大きなリボヌクレオタンパク質複合体によって触媒される。合計で、150以上のタンパク質と5つの小さな核RNA(snRNA)がスプライシング経路の異なる段階でスプライセオソームに統合されています。U1、U2、U4、U5、U6 snRNAは、主要なGU-AGイントロンのスプライシングに参加しています。これらのsnRNAは、snRNAを含む予め形成された小さな核リボヌクレオタンパク質粒子(snRNA)としてスプリセオソームに結合し、snRNAに関連する7つのSmタンパク質(またはU6 snRNAに関連するライクSmタンパク質)および各snRNPに特異的な1-12タンパク質を含む。
snNRPsの組み立てには、細胞質および核段階が含まれる。新たに転写されたsnRNAは細胞質にエクスポートされ、7つのSmタンパク質から組み立てられたリングを獲得する。Smリングは、その後、snRNAを核に再インポートするためのシグナルとして機能します。Smタンパク質と関連付けることができない欠陥のあるsnRNAは、細胞質1に保持される。新しくインポートされたsnRAPは、まずSnRNP特異的タンパク質を満たし、その成熟を終えるCajal体内に現れ(参照2、3で確認)。我々は最近、最終的な成熟ステップの阻害がCajal体内の未熟なsnNRRpの隔離をもたらすことを示した4,5.我々は、snRNP特異的タンパク質の添加と活性snRNPの形成を監視する品質管理下にある最終snRNP成熟モデルを提案した。しかし、細胞が正しく組み立てられた成熟粒子と異常な未熟粒子を区別する方法の分子詳細は、依然として不明瞭なままである。
核カジャール体内のsnRNAの標的化と蓄積に不可欠なsnRNA配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用することにしました。マイクロインジェクションは、1)合成snRNAを区別するために追加のシーケンスタグを必要としないため、余分なタグ配列を挿入するためのスペースが少ない短いRNAにとって特に重要です。2)それは生体発生のために重要な配列の分析を可能にする。たとえば、Sm シーケンスは Sm リング アセンブリに不可欠であり、核6に再インポートします。snRNAが細胞内で発現されると、Sm配列を欠くsnRNAは細胞質中で分解され、核およびCajal体7に到達しない。しかしながら、Sm配列を持たないSnRNAは、核に直接マイクロ注入することができ、したがって、Cajal体局在化におけるSm配列の潜在的な役割をアッセイする。
ここでは、Cajal本体5にsnRNAを標的にするために必要なsnRNA配列を決定するために適用したマイクロインジェクション法について詳しく説明する。我々は、SmおよびSMN結合部位が一緒に必要であり、SnRNAだけでなく、Cajal本体に様々な短い非コーディングRNAをローカライズするのに十分であることを示した。マイクロインジェクションおよび他の証拠に基づいて、Sm結合部位に組み立てられたSMリングがCajal本体ローカリゼーション信号であることを提案した。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを用い、核カジャール体へのsnRNA局在化に重要な配列を決定した。標識されたRNAの迅速かつかなり単純な調製(PCRによるDNAテンプレートの調製、インビトロ転写)により、この方法は、様々な配列がRNA局在化にどのように寄与するかの効果的な分析を提供します。比較的短時間で、U2 snRNAの10種類の欠損または置換を分析することができました(参?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、チェコ科学財団(18-10035S)、国家サステナビリティプログラムI(LO1419)、制度支援(RVO68378050)、欧州地域開発基金(CZ.02.1.01/0.0.0.0.0/0.0/16_013/0001775)、および助成金によって支援されました。チャールズ大学 (GAUK 134516).我々はさらに、光顕微鏡コア施設、IMG CAS、プラハ、チェコ共和国(助成金によってサポートされている-チェコバイオイメージング – LM2015062)を認めます。
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
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