ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה
Summary
ביוגנזה של snRNAs של הספנסאוסיס הוא תהליך מורכב הכולל תאים סלולריים שונים. כאן, אנחנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שוכרים snRNAs כדי לפקח על ההובלה שלהם בתוך התא.
Abstract
ביוגנזה של snRNAs התחתית הוא תהליך מורכב הכרוך הן בשלבים גרעינית, cytoplasmic והשלב האחרון מתרחש בתוך תא גרעיני בשם הגוף Cajal. עם זאת, רצפים הישירים לוקליזציה snRNA למבנה זה תת גרעיני לא ידוע עד לאחרונה. כדי לקבוע רצפים חשובים עבור הצטברות של snRNAs בגופים Cajal, אנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שלהם snRNAs ואחריו הלוקליזציה שלהם בתוך תאים. ראשית, הכנו snRNA מוטנטים מוטציות, מסונתז תבניות דנ א עבור תמלול ושעתוק והעתק snRNAs בנוכחות של UTP ביחד עם Alexa488. מתויג snRNAs היו מעורבים עם 70 kDa-Dextran מצועם TRITC, ו מיקרווזרק לגרעין או ציטופלסמה של תאי הלה האדם. תאים היו מודבטים עבור 1 h ו קבוע את הסמן הגוף Cajal לאסוף היה דמיינו על ידי immunofluorescence עקיף, בעוד snRNAs ו dextran, אשר משמש כסמן של הזרקה גרעינית או cytoplasmic, נצפו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת בדיקה יעילה ומהירה של איך רצפים שונים להשפיע לוקליזציה RNA בתוך תאים. כאן, אנו מראים את החשיבות של רצף מחייב-Sm ללוקליזציה יעיל של snRNAs לתוך הגוף Cajal.
Introduction
שחבור ה-RNA הוא אחד השלבים הקריטיים בביטוי הגנים, אשר מזרז על ידי מתחם ribonucleoprotein גדול הנקרא מתחת לתחתית. בסך הכל, יותר מ 150 חלבונים ו-5 RNAs גרעיני קטן (snRNAs) משולבים לתוך מתחת שלבים בשלבים שונים של המסלול השחבור. U1, U2, U4, U5 ו U6 snRNAs משתתפים בהשתתפות של introns הגדולות גו-AG. SnRNAs אלה להצטרף המאחדים כמו טרום בנוי חלקיקים גרעיניים גרעינית קטנה (Snrnas) המכילים snRNA, שבעה חלבונים Sm הקשורים snRNA (או כמו-Sm חלבונים, אשר מקשרים עם U6 snRNA) ו 1-12 חלבונים ספציפיים עבור כל Snrnas.
הרכבת של snRNPs כוללת cytoplasmic ושלבים גרעיניים. שופץ לאחרונה snRNA מיוצא אל הציטופלסמה שבו הוא רוכש טבעת שנאספו מתוך שבעה חלבונים Sm. הטבעת Sm משמש לאחר מכן כאות לייבא snRNA מחדש חזרה לגרעין. SnRNAs פגומים שאינם משייכים עם חלבונים Sm נשמרים בציטופלסמה1. מיובא snrnps החדש להופיע לראשונה בגוף cajal שבו הם פוגשים snrnps-ספציפיים חלבונים ולסיים את ההבשלה שלהם (נבדקו בהתייחסות2,3). לאחרונה הראינו כי עיכוב של שלבי ההבשלה הסופי תוצאות בקיבוע על של snrnps בוגר בגוף cajal4,5. הצעת מודל שבו ההבשלה snRNP הסופי הוא תחת שליטה איכותית כי מפקחת תוספת של חלבונים ספציפיים snRNP והיווצרות Snrnp פעיל. עם זאת, פרטים מולקולריים של האופן שבו תאים מבחינים בין חלקיקים בוגרים שאינם מפותחים בצורה נכונה, נותרים חמקמקים.
כדי לקבוע רצפים snRNA כי הם חיוניים עבור המיקוד והצטברות של snRNAs בגופים הגרעין Cajal, החלטנו להעסיק מיקרוהזרקה של הסימון מתויג של snRNAs. מיקרוהזרקה היתה שיטה של בחירה כי: 1) זה לא דורש תג רצף נוסף כדי להבחין snRNAs סינתטי טופס עמיתיהם האנדוגניים שהוא חשוב במיוחד עבור RNAs קצר עם מעט מקום להוספה של רצף תג נוסף; 2) הוא מאפשר ניתוח רצפים החשובים עבור biogenesis. לדוגמה, רצף Sm חיוני להרכבת הטבעת Sm ולייבא מחדש לתוך הגרעין6. כאשר snRNAs מבוטא בתא, snRNAs חסר הרצף Sm מושפל בציטופלסמה ולא להגיע הגרעין הגופים Cajal7. עם זאת, snRNAs ללא רצף Sm יכול להיות ישירות מיקרו לתוך הגרעין ולכן תפקיד פוטנציאלי של רצף Sm ב Cajal לוקליזציה של הגוף.
כאן, אנו מתארים בפירוט שיטת מיקרו הזרקה שאנו מיושמים כדי לקבוע רצפים snRNA הנחוצים למקד snRNAs לתוך הגוף Cajal5. הראנו כי האתרים מחייב Sm ו SMN הם ביחד הכרחי ומספיק כדי להתאים לא רק snRNAs, אך שונים RNAs ללא קידוד קצר לתוך הגוף Cajal. מבוסס על הזרקת מיקרו כמו גם ראיות אחרות, הציעו כי טבעת Sm התאספו על האתר מחייב Sm הוא אות הגוף Cajal לוקליזציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו המועסקים מיקרוהזרקה של המסומנת מתויג snRNAs כדי לקבוע רצפים חשובים עבור snRNA לוקליזציה לתוך הגופים הגרעיניים Cajal. בשל הכנה מהירה ופשוטה למדי של RNAs מתויג (הכנת תבנית ה-DNA על ידי PCR ואחריו שעתוק מבחנה) השיטה מציעה ניתוח אפקטיבי של איך רצפים שונים תורמים ללוקליזציה של RNA. בזמן קצר יחסית, הצלחנו ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן המדע הצ (18-10035S), התוכנית הלאומית לקיימות I (LO1419), תמיכה מוסדית (RVO68378050), הקרן האירופית לפיתוח אזורי (COM. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) וסוכנות המענק של אוניברסיטת צ’רלס (GAUK 134516). אנו מכירים בנוסף את מתקן הליבה של מיקרוסקופ האור, IMG CAS, פראג, צ’כיה (נתמך על ידי מענקים (צ’כית-Bioimaging-LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs – friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
