Электрофизиологические записи одноклеточных ионных токов под четко определенным сдвигами
Summary
Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы описать модифицированную камеру потока параллельных пластин для использования в исследовании активации в реальном времени механочувствительных ионных каналов сдвигами.
Abstract
Стресс сдвига жидкости, как известно, играют важную роль в эндотелиальной функции. В большинстве сосудистых кроватей повышенный сдвига стресс от острого увеличения кровотока вызывает сигнальный каскад, приводящий к вазодилатации, тем самым облегчая механическую нагрузку на сосудистую стенку. Структура сдвига стресс также хорошо известно, является критическим фактором в развитии атеросклероза с ламинар сдвига стресс время атеропротектор и нарушенных сдвига стресс про-атерогенных. Хотя у нас есть детальное понимание различных промежуточных клеточных сигнальных путей, рецепторы, которые сначала переводят механический стимул в химических посредников, полностью не поняты. Механочувствительные ионные каналы имеют решающее значение для реагирования на сдвига и регулируют сигнализирующую ячейку, вызывающую таким образом производство вазоактивных посредников. Эти каналы являются одними из самых ранних активированных сигнальных компонентов для сдвига и были связаны с сдвига индуцированной вазодилатации путем поощрения производства оксида азота (например, внутренне выправляя Kи Кира и переходный потенциал рецепторов »TRP» каналы) и эндотелия гиперполяризующий фактор (например, Кир и кальций активированный K »KCa» каналов) и сдвига индуцированного сосудосуживаемого через неопределенный механизм, который включает в себя пьезо каналов. Понимание биофизического механизма, с помощью которого эти каналы активируются силами сдвига (т.е. непосредственно или через первичный механо-рецептор) может обеспечить потенциальные новые цели для решения патофизиологии, связанной с эндотелиальной дисфункцией и атерогенез. По-прежнему существует серьезная проблема для записи потокиндуированной активации ионных каналов в режиме реального времени с помощью электрофизиологии. Стандартные методы, позволяющие подвергнуть клетки четко определенному стрессу сдвига, таким как конус и реометр пластин и замкнутая камера потока параллельной пластины, не позволяют в режиме реального времени изучать активацию ионного канала. Целью этого протокола является описание модифицированной параллельной камеры потока пластины, которая позволяет в режиме реального времени электрофизиологической записи механочувствительных ионных каналов под четко определенным напряжением сдвига.
Introduction
Гемодинамические силы, генерируемые кровотоком, хорошо известны, играют важную роль в эндотелиальной и сосудистой функции1,2. Также хорошо известно, что несколько типов ионных каналовостро реагируют на изменения в стрессе сдвига 3,4,5, что приводит к гипотезе, что ионные каналы могут быть первичными датчиками стресса сдвига. Совсем недавно мы и другие показали, что механочувствительные ионные каналы играют важную роль в нескольких сдвига стресса чувствительных сосудистых функций, в том числе вазоактивной реакции на сдвига стресс6,7,8 , и развития ангиогенез9. Механизмы чувствительности сдвига-стресса ионных каналов, однако, почти полностью неизвестны. Этот пробел в знаниях, вероятно, объясняется технической сложностью выполнения электрофизиологических записей при четко определенном стрессе сдвига. В этой статье, таким образом, мы предоставляем шаг за шагом подробныйпротокол обычно выполняется в нашей лаборатории для достижения этой цели 6,7,10,11.
Общая цель этого метода заключается в том, чтобы в режиме реального времени исследование ионного канала механоактивации под четко определенным напряжением сдвига в физиологическом диапазоне. Это достигается путем изменения стандартной параллельной камеры потока пластины, чтобы электрофизиологические пипетки, которые будут опущены в камеру и доступа клеток, выращенных на нижней пластине в режиме реального времени воздействия потока, обеспечивая уникальный подход для достижения этой цели цель6,7,11. В отличие от стандартных параллельных камер потока пластин, описанных в предыдущих публикациях может быть использован для анализа изображений в режиме реального времени клеток, подверженных сдвига сил12 или других неинвазивных подходов13,14, но не для Электрофизиологии. Аналогичным образом, конус и пластины аппарата, другой мощный подход подвергать клетки сдвига стресс15,16 также не подходит для электрофизиологических записей. Таким образом, эти устройства потока не позволяют исследуемую чувствительность напряжения сдвига ионных каналов. Трудность в выполнении электрофизиологических записей под потоком является основной причиной скудности информации о механизмах, ответственных за эти решающие эффекты.
С точки зрения альтернативных подходов к достижению той же цели, нет ни одного, кто был бы столь точным или контролируемым. Некоторые более предыдущие изучения попытались зафиксировать деятельность канала иона под потоком путем подвергать действию клетки к потоку жидкости приходя от другого pipette принесенных к vicinity клетки от выше17,18. Это очень нефизиологическое, так как механические силы, генерируемые в этих условиях, имеют мало общего с физиологическими профилями сдвига стресса в кровеносных сосудах. Аналогичные опасения относятся к попыткам имитировать физиологический стресс сдвига путем перфузии открытых камер. Как подробно описано в нашем предыдущем исследовании10, открытый жидко-воздушный интерфейс создает многочисленные нарушения и рециркуляции, которые являются нефизиологическими. Для решения всех этих проблем, мы разработали модифицированную параллельную пластину (MPP) системы подачи, также именуемую “минимально инвазивным устройством потока” в наших предыдущих исследованиях6,7,10,11, от акрила и широко используется в нашей лаборатории. Однако, несмотря на то, что оригинальное описание дизайна было опубликовано почти 20 лет назад и является единственным устройством потока, которое позволяет выполнять электрофизиологические записи под четко определенным напряжением сдвига, эта методология не была принятые другими лабораториями и Есть только очень мало исследований, которые пытаются зафиксировать токи под потоком. Поэтому мы считаем, что предоставление подробного описания для использования камеры потока MPP будет большим подспорьем для исследований, которые заинтересованы в механочувствительных ионных каналов и сосудистой биологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сосудистая система постоянно подвергается воздействию активных гемодинамических сил, которые активируют механочувствительные ионные каналы3,22, но физиологические роли этих каналов в сдвига стресс-индуцированной механотрансдукции только начинают поя…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальным институтом сердца, легких и крови (R01 HL073965, IL) и (T32 HL007829-24, ISF). Авторы также хотели бы отметить, Научная машина магазин в Университете Иллинойса в Чикаго для генерации наших последних MPP потока камер.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?. Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of ‘Shear Rings’: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
