Gravações electrofisiológicas de correntes do íon da único-pilha o esforço de tesoura bem definido
Summary
O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada para uso na investigação da ativação em tempo real de canais de íons mecanosensíveis por tensão de cisalhamento.
Abstract
O stress de cisalhamento fluido é bem conhecido por desempenhar um papel importante na função endotelial. Na maioria das camas vasculares, o estresse de cisalhamento elevado de aumentos agudos no fluxo sanguíneo desencadeia uma cascata de sinalização resultando em vasodilatação, aliviando assim o estresse mecânico na parede vascular. O padrão de estresse de cisalhamento também é bem conhecido por ser um fator crítico no desenvolvimento da aterosclerose com estresse de cisalhamento laminar sendo aterogênico e perturbado o estresse de cisalhamento sendo pró-aterogénico. Quando nós tivermos uma compreensão detalhada das várias vias intermediárias da sinalização da pilha, os receptores que traduzem primeiramente o estímulo mecânico em mediadores químicos não são compreendidos completamente. Os canais de íons mecanosensíveis são fundamentais para a resposta ao cisalhamento e regulam a sinalização celular induzida por cisalhamento, controlando assim a produção de mediadores vasoativos. Esses canais estão entre os primeiros componentes de sinalização ativados para cisalhamento e foram vinculados à vasodilatação induzida por cisalhamento por meio da promoção da produção de óxido nítrico (por exemplo, retificando internamente K+ [Kir] e potencial de receptor transitório [TRP] canais) e fator de hiperpolarização do endotélio (por exemplo, canais Kir e K+ [KCA] ativados por cálcio) e vasoconstrição induzida por cisalhamento por meio de um mecanismo indeterminado que envolve canais piezo. Compreender o mecanismo biofísico pelo qual esses canais são ativados por forças de cisalhamento (ou seja, diretamente ou através de um Mecano-receptor primário) poderia fornecer potenciais novos alvos para resolver a fisiopatologia associada à disfunção endotelial e aterogênese. Ainda é um grande desafio para registrar a ativação induzida por fluxo de canais iônicos em tempo real usando eletrofisiologia. Os métodos padrão para expor as células à tensão de cisalhamento bem definida, como o Reômetro de cone e placa e a câmara de fluxo de placa paralela fechada, não permitem o estudo em tempo real da ativação do canal iônico. O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada que permita a gravação eletrofisiológica em tempo real de canais de íons mecanosensíveis estresse de cisalhamento bem definido.
Introduction
As forças hemodinâmicas geradas pelo fluxo sanguíneo são bem conhecidas por desempenhar papéis importantes na função endotelial e vascular1,2. É sabido igualmente que diversos tipos de canaletas do íon respondem agudamente às mudanças no esforço de tesoura3,4,5 que conduzem à hipótese que os canais de íon podem ser sensores preliminares do esforço de tesoura. Mais recentemente, nós e outros mostramos que os canais iônicos mecanosensíveis desempenham papéis críticos em várias funções vasculares sensíveis ao cisalhamento-stress, incluindo a resposta vasoativa ao estresse de cisalhamento6,7,8 e angiogênese do desenvolvimento9. Os mecanismos da sensibilidade do cisalhamento-stress de canaletas do íon, entretanto, são quase totalmente desconhecidos. Esta lacuna de conhecimento é susceptível de ser devido à dificuldade técnica de realizar gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido. Neste artigo, portanto, fornecemos um protocolo detalhado passo a passo rotineiramente realizado em nosso laboratório para atingir esse objetivo6,7,10,11.
O objetivo geral deste método é permitir a investigação em tempo real da mecanoativação do canal iônico estresse de cisalhamento bem definido na faixa fisiológica. Isto é conseguido modificando uma câmara paralela padrão do fluxo da placa para permitir que uma pipeta eletrofisiológicos seja abaixada na câmara e as pilhas do acesso crescidas na placa inferior durante a exposição do tempo real ao fluxo, fornecendo uma aproximação original para conseguir este objetivo6,7,11. Em contrapartida, as câmaras de fluxo de placas paralelas padrão, descritas em publicações anteriores, podem ser utilizadas para a análise de imagens em tempo real de células expostas a forças de cisalhamento12 ou outras abordagens não invasivas13,14, mas não para Eletrofisiologia. Similarmente, o cone e o instrumento da placa, uma outra aproximação poderosa para expor pilhas ao esforço de cisalhamento15,16 não são igualmente apropriados para gravações electrofisiológicas. Assim, estes dispositivos de fluxo não permitem a investigação da sensibilidade de tensão de cisalhamento de canais iônicos. A dificuldade em realizar gravações eletrofisiológicas fluxo é a principal razão para a escassez de informações sobre os mecanismos responsáveis por esses efeitos cruciais.
Em termos das abordagens alternativas para atingir o mesmo objetivo, não há nenhum que são tão precisos ou controlados. Alguns estudos anteriores tentaram registrar a atividade do canal iônico fluxo, expondo as células a um fluxo de líquido proveniente de outra pipeta trazida para a vizinhança de uma célula de acima de17,18. Isto é altamente não-fisiológico, como as forças mecânicas geradas nestas condições têm pouco em comum com os perfis fisiológicos de tensão de cisalhamento nos vasos sanguíneos. As preocupações similares aplicam-se às tentativas de simular o stress fisiológico da tesoura pela perfusão de câmaras abertas. Como discutido em detalhe em nosso estudo mais adiantado10, uma relação aberta do líquido-ar cria distúrbios e recirculação múltiplos, que são não-physiological. Para endereçar todas estas preocupações, nós projetamos uma câmara paralela modificada do fluxo da placa (MPP), igualmente referida como o “dispositivo minimamente invasor do fluxo” em nossos estudos mais adiantados6,7,10,11, feitos de acrílico e amplamente utilizado em nosso laboratório. No entanto, apesar do fato de que a descrição original do projeto foi publicada há quase 20 anos e é o único dispositivo de fluxo que permite a realização de gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido, esta metodologia não foi adotados por outros laboratórios e há poucos estudos que tentam registrar correntes fluxo. Acreditamos, portanto, que fornecer uma descrição detalhada para o uso da câmara de fluxo MPP será de grande ajuda para pesquisas que estão interessadas em canais iônicos mecanosensíveis e biologia vascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema vascular está constantemente exposto a forças hemodinâmicas ativas, que ativam os canais deíons mecanosensíveis,22 mas os papéis fisiológicos desses canais na mecanotransdução induzida por estresse de cisalhamento são apenas começando a emergir4,6,8. Os mecanismos responsáveis pela mecanosensibilidade dos canais ativados por estresse de cisalhamento…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do coração, pulmão e sangue (R01 HL073965, IL) e (T32 HL007829-24, ISF). Os autores também gostariam de reconhecer a oficina de máquinas científicas na Universidade de Illinois, em Chicago, por gerar nossas mais recentes câmaras de fluxo MPP.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?. Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of ‘Shear Rings’: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
