التسجيلات الكهرولوجية للتيارات الأيونية أحادية الخلية تحت ضغط القص المحدد جيداً
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تعديل غرفة تدفق لوحة موازية لاستخدامها في التحقيق في الوقت الحقيقي تفعيل قنوات أيون mechanosensitive عن طريق الإجهاد القص.
Abstract
ومن المعروف جيدا الإجهاد القص السائل للعب دور رئيسي في وظيفة بطانة الرحم. في معظم أسرّة الأوعية الدموية، يؤدي ارتفاع ضغط القص الناتج عن الزيادات الحادة في تدفق الدم إلى سلسلة إشارة تؤدي إلى توسع الأوعية مما يخفف من الضغط الميكانيكي على جدار الأوعية الدموية. ومن المعروف جيدا أن نمط الإجهاد القص أن يكون عاملا حاسما في تطوير تصلب الشرايين مع الإجهاد القص laminar يجري atheroprotective واضطراب الإجهاد القص كونها المؤيدة للأثيروجينيك. في حين أن لدينا فهم مفصل لمختلف مسارات إشارة الخلية المتوسطة، لا يتم فهم المستقبلات التي تترجم أولا التحفيز الميكانيكي إلى وسطاء الكيميائية تماما. القنوات الأيونية المشانية حاسمة في الاستجابة للقص وتنظيم إشارات الخلايا التي يسببها القص وبالتالي السيطرة على إنتاج الوسطاء vasoactive. هذه القنوات هي من بين أقدم مكونات الإشارات المنشطة للقص، وقد تم ربطها بتوسع الأوعية الناجم عن القص من خلال تعزيز إنتاج أكسيد النيتريك (على سبيل المثال، تصحيح داخلي K+ [Kir] ومستقبلات عابرة المحتملة [TRP] القنوات) وعامل فرط الاستقطاب البطانة (على سبيل المثال، كير والكالسيوم تنشيط K+ [KCa] القنوات) والقص الناجم ة مضيق للأوعية من خلال آلية غير محددة التي تنطوي على قنوات بيزو. فهم الآلية البيوفيزيائية التي يتم من خلالها تنشيط هذه القنوات من قبل قوى القص (أي مباشرة أو من خلال مستقبلات الميكانو الأولية) يمكن أن توفر أهدافا جديدة محتملة لحل الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة باختلال البطانة والتكوين الهيروي. لا يزال تحديا كبيرا لتسجيل تدفق الناجمة عن تفعيل قنوات أيون في الوقت الحقيقي باستخدام الفيزيولوجيا الكهربائية. الطرق القياسية لتعريض الخلايا لإجهاد القص محددة جيدا، مثل مخروط ولوحة مقياس الرطوبة وأغلقت غرفة تدفق لوحة موازية لا تسمح دراسة في الوقت الحقيقي من تنشيط قناة أيون. والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تعديل غرفة تدفق لوحة موازية التي تسمح في الوقت الحقيقي تسجيل الكهربائية الفسيولوجية من قنوات أيون mechanosensitive تحت الإجهاد القص محددة جيدا.
Introduction
ومن المعروف جيدا أن القوى الهيمودينامية الناتجة عن تدفق الدم تلعب أدوارا رئيسية في وظيفة البطانة والأوعية الدموية1،2. ومن المعروف جيدا أيضا أن عدة أنواع من القنوات أيون تستجيب بشكل حاد للتغيرات في الإجهاد القص3،4،5 مما يؤدي إلى فرضية أن قنوات أيون يمكن أن تكون أجهزة استشعار الإجهاد القص الأولية. في الآونة الأخيرة، أظهرنا نحن وآخرون أن قنوات الأيون المشانية الحساسة تلعب أدوارًا حاسمة في العديد من وظائف الأوعية الدموية الحساسة للقص الإجهاد، بما في ذلك الاستجابة الوعية الدموية لإجهاد القص6و7و8 ، وتكوين الأوعية التنموية9. ومع ذلك، فإن آليات حساسية الضغط على القص لقنوات الأيون غير معروفة تماماً تقريباً. ومن المرجح أن تكون هذه الفجوة في المعرفة بسبب الصعوبة التقنية في أداء التسجيلات الفسيولوجية الكهربائية تحت ضغط القص المحدد جيداً. في هذه المقالة، لذلك، ونحن نقدم خطوة خطوة بروتوكول مفصل ةيتم تنفيذها بشكل روتيني في مختبرنا لتحقيق هذا الهدف 6،7،10،11.
الهدف العام لهذه الطريقة هو السماح بالتحقيق في الوقت الحقيقي من قناة أيون mechanoactivation تحت الإجهاد القص محددة جيدا في النطاق الفسيولوجي. ويتحقق ذلك عن طريق تعديل غرفة تدفق لوحة موازية القياسية للسماح للماصة الكهربائية الفسيولوجية ليتم خفضها في الغرفة والوصول إلى الخلايا المزروعة على لوحة أسفل خلال التعرض في الوقت الحقيقي للتدفق، وتوفير نهج فريد لتحقيق هذا الهدف6و7و11. وعلى النقيض من ذلك، يمكن استخدام غرف تدفق اللوحة المتوازية القياسية، الموصوفة في المنشورات السابقة لتحليل التصوير في الوقت الحقيقي للخلايا المعرضة لقوى القص12 أو غيرها من النهج غير الغازية13،14 ولكن ليس ل الفيزيولوجيا الكهربائية. وبالمثل، مخروط ولوحة الجهاز، نهج قوي آخر لفضح الخلايا لالإجهاد القص15،16 ليست أيضا مناسبة للتسجيلات الكهرولوجية. وبالتالي، فإن هذه الأجهزة تدفق لا تسمح بالتحقيق في حساسية الإجهاد القص من قنوات أيون. وصعوبة إجراء التسجيلات الكهرولوجية تحت التدفق هي السبب الرئيسي لندرة المعلومات عن الآليات المسؤولة عن هذه الآثار الحاسمة.
وفيما يتعلق بالنهج البديلة لتحقيق نفس الهدف، لا توجد أي نُهج دقيقة أو خاضعة للرقابة. حاولت بعض الدراسات السابقة تسجيل نشاط قناة أيون تحت التدفق عن طريق تعريض الخلايا لتيار من السائل القادم من ماصة أخرى جلبت إلى محيط خلية من فوق17،18. هذا هو غير الفسيولوجية للغاية، والقوى الميكانيكية التي تم إنشاؤها في ظل هذه الظروف لديها القليل من القواسم المشتركة مع الملامح الفسيولوجية للإجهاد القص في الأوعية الدموية. وتنطبق شواغل مماثلة على محاولات محاكاة الإجهاد الفسيولوجي للقص عن طريق التسريب من الغرف المفتوحة. كما نوقش بالتفصيل في دراستنا السابقة10، واجهة الهواء السائل مفتوحة يخلق اضطرابات متعددة وإعادة تدوير ، والتي هي غير الفسيولوجية. لمعالجة كل هذه المخاوف، قمنا بتصميم لوحة موازية معدلة (MPP) غرفة تدفق، ويشار إليهاأيضا باسم “جهاز تدفق طفيفالتوغل” في دراساتنا السابقة 6،7،10،11،أدلى من الاكريليك وتستخدم على نطاق واسع في مختبرنا. ومع ذلك، على الرغم من حقيقة أن الوصف الأصلي للتصميم قد نشرت منذ ما يقرب من 20 عاما، وهو جهاز التدفق الوحيد الذي يسمح بإجراء تسجيلات الكهرولوجيسية تحت الإجهاد القص محددة جيدا، لم تكن هذه المنهجية التي اعتمدتها مختبرات أخرى، وهناك فقط عدد قليل جدا من الدراسات التي تحاول تسجيل التيارات تحت التدفق. ولذلك، نعتقد أن تقديم وصف مفصل لاستخدام غرفة تدفق MPP سيكون عونا كبيرا للبحوث الذين يهتمون قنوات أيون mechanosensitive وبيولوجيا الأوعية الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتعرض نظام الأوعية الدموية باستمرار لقوى الهيمودينامية النشطة، والتي تنشط القنوات الأيونية mechanosensitive3،22 ولكن الأدوار الفسيولوجية لهذه القنوات في القص الناجم عن الإجهاد mechanotransduction هو فقط بدأت تظهر4،6،8. ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R01 HL073965، IL) و (T32 HL007829-24، ISF). كما يود المؤلفون أن ينوه بمتجر الآلات العلمية في جامعة إلينوي في شيكاغو لتوليد أحدث غرف تدفق MPP لدينا.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?. Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of ‘Shear Rings’: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
