JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

Dairesel RNA’lar üreten muhabir genleri klonlayıp analiz ediyoruz. Bu muhabir genler doğrusal birleştirme analiz etmek ve Alu elemanları içeren yapılar daha büyüktür. Dairesel RNA’ları araştırmak için yapılar hücrelere dönüştürülr ve doğrusal RNA çıkarıldıktan sonra RT-PCR kullanılarak ortaya çıkan RNA analiz edilir.

Abstract

Lineer mRNA’lara ek olarak, birçok ökaryotik gen dairesel RNA’lar üretir. Çoğu dairesel RNA, 5’li bir splice sitesine, bir ön mRNA içinde 3′ splice sitesi ile katılarak oluşturulur, bu süreç geri birleştirme olarak adlandırılır. Bu daireselleştirme büyük olasılıkla pre-mRNA ikincil yapılar tarafından desteklenir yakın içine splice siteleri getirmek. İnsan genlerinde, Alu elementleri bu ikincil RNA yapılarını teşvik eder, çünkü Alu elementleri bol miktarda bulunur ve mRNA öncesi zıt yönlerde mevcut olduğunda birbirleriyle baz tamamlayıcılıkları sergilerler. Burada dairesel RNA’lar oluşturan muhabir genleri içeren büyük Alu elementinin üretimini ve analizini tanımlıyoruz. Klonlama protokollerinin optimizasyonu ile 20 kb kesici uç uzunluğuna sahip muhabir genler oluşturulabilir. Ortak transfeksiyon deneylerindeki analizleri düzenleyici faktörlerin tanımlanmasına olanak sağlar. Böylece, bu yöntem dairesel RNA oluşumunda yer alan RNA dizilerini ve hücresel bileşenleri tanımlayabilir.

Introduction

Dairesel RNA’lar
Dairesel RNA’lar (circRNA’lar) kovalent olarak kapalı tek iplikçikli RNA’lar çoğu organizmada ifade edilir. Onlar bir downstream 5 ‘splice site, bir upstream 3’ splice siteye katılarak oluşturulur, bir süreç geri birleştirme denir (Şekil 1A)1. 30-40 nt gibi kısa baz tamamlayıcı sergileyen pre-mRNA dizileri circRNA oluşumu2için uygun hizalama içine geri-splice siteleri getirmek . İnsanlarda, Alu elemanları1,genomunyaklaşık% 11 temsil 3 , kendi kendini tamamlayıcılık nedeniyle pre-mRNA geniş çift telli RNA yapıları oluşturmak4,5 ve böylece circRNAoluşumunuteşvik 1 .

Şu anda circRNA’ların üç ana işlevi tanımlanmıştır. Bazı circRNA’lar mikroRNA’ları (miRNA’lar) bağlar ve miRNA süngerleri gibi tutma hareketi ile6. CircRNA’lar transkripsiyonel ve post transkripsiyonel düzenlemeye, doğrusal birleştirme7 veya transkripsiyon faktörüaktivitesininmodülasyonu ile rekabet yoluyla 8. Son olarak, circRNA kısa açık okuma çerçeveleri ve ilke çalışmalarıkanıtı içeren 9,10tercüme edilebilir göstermektedir. Ancak, en circRNA fonksiyonu esrarengiz kalır. Dairesel RNA’ların çoğu yeni nesil sıralama yöntemleri kullanılarak tespit edilmiştir11. Hedeflenen RT-PCR yaklaşımları kullanılarak bireysel genlerin ayrıntılı analizleri, çok sayıda dairesel RNA’nın12.

Pre-mRNA işleme analiz etmek için muhabir genlerin kullanımı
DNA muhabirinden elde edilen mRNA’nın hücrelere transfekte olan yapılarından elde edilen mRNA’nın analizi, dairesel RNA’lara uygulanabilen alternatif pre-mRNA birleştirme yi incelemek için kurulmuş bir yöntemdir. Genel olarak, alternatif ekson, çevresindeki intronlar ve kurucu ekonlar yükseltilir ve ökaryotik ifade vektörü içine klonlanır. Sık sık, intronlar kısalır. Yapılar ökaryotik hücrelere dönüştürüldü ve genellikle RT-PCR13,14tarafından analiz edilir. Bu yaklaşım, ortak transfeksiyon deneylerinde düzenleyici splice sitelerinin ve trans-etkili faktörlerin haritalarında yaygın olarak kullanılmıştır13,15,16,17,18. Buna ek olarak, protein ifade minigenlerin üretimi alternatif birleştirme değiştiren maddelerin taranması için izin19,20.

Yöntem dairesel RNA’lara uygulanmıştır. Literatürde en az 12 minigen omurgası tanımlanmış ve Tablo 1’deözetlenmiştir. TRNA tabanlı ifade sistemi21,22dışında hepsi polimeraz II organizatörleri bağlıdır. Burada, dairesel RNA’ların oluşumunda yer alan cis ve trans-acting faktörleri belirlemek için insan muhabir minigenleri oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Yayınlanan muhabir gen23 dizilerini kullanarak yönteme genel bir bakış Şekil 1’degösterilmiştir.

Protocol

1. Yapıların tasarımı Dairesel RNA oluşumu için gerekli tekrarlayan elementleri belirlemek ve bunları yapılara dahil etmek için UCSC genomtarayıcısı 24’ü kullanın. Daha da önemlisi, amplifikasyon için astartekrarlayan elemanların dışında olması gerekir. Dairesel RNA dizisini(Tamamlayıcı Şekil 1 bir test dizisidir) https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command…

Representative Results

Muhabir genleri dairesel RNA oluşumunu etkileyen düzenleyici faktörlerin belirlenmesine olanak sağlar. Ancak, bu muhabir genler büyük tür ve genellikle DNA yapılarını kararsız hale getiren tekrarlayan elementler içerir. Büyük boyutları nedeniyle, genellikle eksonve daha küçük yan intronic parçalar içeren genomik parçaların yükseltilmesi ile elde edilen intronların bazı kısımlarını silmek gerekir. Bu DNA parçaları enzimatik olarak biraraya getirilerek konstrüksiyon enzimleri olmadan yapılm…

Discussion

Genel olarak, dairesel RNA’lar düşükboldur 1, bu da onların fonksiyon ve oluşumunun incelenmesini zorlaştırır. Lineer RNA13benzer , muhabir minigenlerin kullanımı dairesel RNA oluşumunu düzenleyen cis ve trans-etkili faktörlerin belirlenmesini sağlar. Böylece, bu yaklaşım daha da endojen genler kullanılarak test edilebilir hipotezler oluşturur.

En kritik adım muhabir genin tasarımıdır. DNA parçalarının enzimatik montajı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Savunma Bakanlığı DoD hibe AZ180075 tarafından desteklenmiştir. Stefan Stamm teşekkürler Jacqueline Noonan Vakfı. Anna Pawluchin DAAD, Alman akademik değişim programı tarafından desteklenen, Justin R. Welden University of Kentucky Max Steckler Ödülü’nü aldı.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Tags

Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image