JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Использование элемента Alu, содержащего минигены, для анализа циркулярных РНК

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

Мы клонируем и анализируем гены репортеров, генерирующие круговые РНК. Эти гены репортеров больше, чем конструкции для анализа линейного сращивания и содержат элементы Alu. Для исследования циркулярных РНК конструкции трансфицируются в клетки и в результате РНК анализируется с помощью РТ-ПЦР после удаления линейной РНК.

Abstract

В дополнение к линейным мРНК, многие эукариотические гены генерируют круглые РНК. Большинство круглых РНК генерируются путем присоединения 5′ сращивания сайта с вверх по течению 3 ‘ сращивания сайта в рамках предварительной мРНК, процесс, называемый обратно-сплайсинг. Эта круговая речь, вероятно, способствует вторичных структур в предварительном MRNA, которые приносят сращивания сайтов в непосредственной близости. В человеческих генах, Элементы Alu, как полагают, способствуют эти вторичные структуры РНК, как Алу элементы в изобилии и экспонат базы взаимодополняемости друг с другом, когда присутствуют в противоположных направлениях в предварительном mRNA. Здесь мы описываем генерацию и анализ большого элемента Алу, содержащего репортёрские гены, образующие круглые РНК. Благодаря оптимизации протоколов клонирования могут образоваться гены репортеров длиной до 20 кб. Их анализ в экспериментах по сотрансфокации позволяет выявить регуляторные факторы. Таким образом, этот метод может определить последовательности РНК и клеточных компонентов, участвующих в круговой рнкобразования.

Introduction

Круговые РНК
Круговые РНК (циркрнки) являются ковалентно закрытыми одноцепочечными РНК, которые выражаются в большинстве организмов. Они генерируются путем присоединения вниз по течению 5 ‘ сращивания сайт вверх по течению 3 ‘ сращивания сайта, процесс называется обратно-сращивания (Рисунок 1А)1. Последовательности в pre-mRNA, которые демонстрируют базу, дополняемую как короткие, как 30-40 nt принести обратно-сращивания сайтов в надлежащее выравнивание для формирования циркрнки2. У людей, Alu элементы1, представляющие около 11% генома3, образуют обширные двойные структуры РНК в предварительном mRNA из-за их самокомплементи4,5 и тем самым способствовать образованиюциркрнки 1.

В настоящее время описаны три основные функции циркрнки. Некоторые циркрнки связывают микроРНК (миРНК) и через секвестр действуют как губки miRNA6. CircRNAs были вовлечены в транскрипционной и после транскрипции регулирования, через конкуренцию с линейным сращивания7 или модуляции транскрипции фактор деятельности8. Наконец, циркорные системы содержат короткие открытые рамки для чтения, и доказательства принципиальных исследований показывают, что их можно перевести9,10. Тем не менее, функция большинства циркрнок остается загадочной. Большинство круглых РНК были обнаружены с использованием методов секвенирования следующего поколения11. Детальный анализ отдельных генов с использованием целевых подходов RT-PCR показывает, что большое количество круговых РНК еще предстоит обнаружить12.

Использование генов репортеров для анализа обработки предварительной мРНК
Анализ мРНК, полученных из ДНК-репортер агонстративных транссексуалов в клетки является устоявшимся методом для изучения альтернативных пре-мРНК сращивания, которые могут быть применены к круговой РНК. В общем, альтернативный экзон, окружающие его интроны и составные экзоны усиливаются и клонируются в вектор эукариотического выражения. Часто интроны сокращаются. Конструкции трансфицируются в эукариотические клетки и обычно анализируются RT-PCR13,14. Этот подход широко используется для картирования нормативных сращивания сайтов и транс-действующих факторов в экспериментах по со-трансфекции13,15,16,17,18. Кроме того, генерация белково-выражающих минигенов допускается скрининг веществ, которые меняют альтернативное сращивание19,20.

Метод применяется к циркулярным РНК. В настоящее время, по крайней мере 12 минигенных позвоночников были описаны в литературе и кратко изложены в таблице 1. За исключением системы экспрессии на основе tRNA21,22, все они зависят от промоутеров полимераза II. Здесь мы описываем метод генерации минигенов репортера для определения циси и транс-действующих факторов, участвующих в генерации круговых РНК. Обзор метода с использованием последовательностей опубликованного гена репортера23 показан на рисунке 1.

Protocol

1. Проектирование конструкций Используйте браузер генома UCSC24 для выявления повторяющихся элементов, необходимых для формирования круговой РНК, и их включения в конструкции. Важно отметить, что грунтовки для усиления должны быть вне повторяющихся элементов. Вст?…

Representative Results

Гены репортеров позволяют определить регуляторные факторы, влияющие на формирование круговой РНК. Тем не менее, эти гены репортера являются большими и содержат повторяющиеся элементы, которые часто делают днк конструкции нестабильными. Из-за их большого размера, часто необходимо удал…

Discussion

В целом, круговые РНК являются низкими обильными1,что усложняет изучение их функции и формирования. Подобно линейным РНК13,использование репортера minigenes позволяет определить cis и транс-действующих факторов, которые регулируют формирование круговых РНК. Таким о…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Министерством обороны Министерства обороны грант a180075. Stefan Stamm благодарит фонд Jacqueline Noonan. Анна Павлючина была поддержана DAAD, немецкая программа академического обмена, Джастин Р. Уэлден был получателем Университета Кентукки Макс Стеклер премии.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Tags

Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image