JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

אנחנו לשכפל ולנתח גנים עיתונאי יצירת RNAs מעגלית. גנים כתבת אלה גדולים יותר מאשר בנייה כדי לנתח שחבור ליניארי ולהכיל Alu אלמנטס. כדי לחקור את RNAs מעגלית, המבנים הם מנותחים לתוך תאים וכתוצאה מכך RNA מנותח באמצעות RT-PCR לאחר הסרת RNA ליניארי.

Abstract

בנוסף mrnas ליניארי, הרבה גנים איקריוטית ליצור rnas מעגלית. מרבית ה-RNAs המעגלי מופקים על-ידי הצטרפות לאתר של 5 ‘ אחוי עם אתר אחוי במעלה 3 ‘ בתוך מקדם-mRNA, תהליך הנקרא שחבור חזרה. מעגליות זה עשוי לסייע על ידי מבנים משניים ב-pre-mRNA המביאים את האחוטים לקרבת מקומות. בגנים האנושיים, alu אלמנטס נחשבים לקידום אלה מבנים RNA משני, כמו alu אלמנטס הם שופע בסיס התצוגה משלימה אחד עם השני כאשר נוכח הכיוונים הנגדיים ב pre-mrna. כאן, אנו מתארים את הדור ואת הניתוח של גדול, Alu אלמנט המכיל גנים עיתונאי היוצרים rnas מעגלית. באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקולי שיבוט, גנים עיתונאי עם עד 20 kb אורך להוסיף ניתן ליצור. הניתוח שלהם בניסויים מאפשר זיהוי של גורמי רגולציה. כך, שיטה זו יכולה לזהות רצפי RNA ורכיבים סלולריים המעורבים במערך RNA מעגלי.

Introduction

RNAs מעגלית
RNAs מעגלית (circRNAs) הם סגורים בודד שנתקע יחיד RNAs אשר מבוטא ברוב האורגניזמים. הם מופקים על ידי הצטרפות במטה 5 ‘ אחוי אתר לאתר במעלה 3 ‘ אחוי, תהליך הנקרא שחבור חזרה (איור 1א)1. רצפים של pre-mRNA כי התערוכה בסיס משלימה קצר כמו 30-40 nt להביא החזרה האתר ליישור הנכון עבור מערך circRNA2. בבני אדם, Alu אלמנטס1, המייצג כ -11% של הגנום3, טופס נרחב כפול תקוע מבנים RNA ב pre-mrna בשל העצמיות העצמית שלהם4,5 ובכך לקדם את היווצרות circrnas1.

כיום תוארו שלוש פונקציות עיקריות של circRNAs. חלק מהמעגלי האיגוד מסוג circRNAs (miRNAs) ובאמצעות קיבוע על לפעול כמו ספוגים Mirnas6. באמצעות תחרות עם שחבור ליניארי7 או אפנון של פעילות שעתוק8, היתה מעורב ביניהם מעורבים. לבסוף, מכילים circrnas מסגרות קריאה פתוחות קצרות והוכחת מחקרים עקרוניים מראים כי ניתן לתרגמו9,10. עם זאת, התפקוד של רוב הcircrnas נשאר באופן חידתי. רוב RNAs מעגלית זוהו באמצעות שיטות רצף הדור הבא11. ניתוחים מפורטים של גנים בודדים באמצעות ממוקדות RT-PCR גישות לגלות כי מספר גדול של RNAs מעגלית נשאר להתגלות12.

שימוש בגנים של כתבת לניתוח עיבוד טרום-mRNA
ניתוח mRNA נגזר המבנה כתב DNA בנייה לתוך תאים היא שיטה מבוססת היטב כדי ללמוד אלטרנטיבה טרום mRNA שחבור, אשר ניתן להחיל על RNAs מעגלית. באופן כללי, האקסוקה החלופית, האינטרוטונים המקיפים אותה, והרחבות הקונסטיטוטיביות מושוכגות לתוך וקטור ביטוי של איקריוטית. לעתים קרובות, האינטרונים מקוצרים. המבנים מנותחים לתאי איקריוטית ומנותח בדרך כלל על ידי RT-PCR13,14. גישה זו הייתה בשימוש נרחב כדי למפות את האזורים הרגולטורים וגורמי משחק בניסויים שיתוף פעולה13,15,16,17,18. בנוסף, הדור של ביטוי חלבון מיני גנים מותר להקרנה של חומרים המשנים שחבור חלופיים19,20.

השיטה הוחלה על RNAs מעגלית. כיום, לפחות 12 מיניגנים לאחור תוארו בספרות ומסוכמים בטבלה 1. למעט מערכת trna ביטוי מבוסס21,22, הם כולם תלויים פולימראז השני היזמים. כאן, אנו מתארים שיטה ליצור מיני העיתונאי האנושי כדי לקבוע את הגורמים העמים והטרנס משחק מעורב בדור של RNAs מעגלית. מבט כולל על השיטה באמצעות רצפים של העיתונאי שפורסם גן23 מוצג באיור 1.

Protocol

1. עיצוב המבנים השתמש בדפדפן UCSC הגנום24 לזהות אלמנטים חוזרים הדרושים עבור היווצרות RNA מעגלי ולשלב אותם במבנים. חשוב ביותר, התחל הגברה של הצורך להיות מחוץ ליסודות החוזרים. הדבקת רצף ה-RNA המעגלי (איור משלים 1 הוא רצף מבחנים) לתוך <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start…

Representative Results

גנים עיתונאי לאפשר נחישות של גורמים הרגולציה המשפיעים על היווצרות RNA מעגלי. עם זאת, גנים כתבת אלה הם גדולים ומכילים אלמנטים חוזרים כי לעתים קרובות לעשות בנייה DNA לא יציב. בשל גודלם הגדול, לעתים קרובות יש צורך למחוק חלקים של introns, אשר מושגת על ידי הגברה של חתיכות גנומית המכילה exons וחלקים קטנים …

Discussion

באופן כללי, RNAs מעגלית נמוך1שופע, אשר מסבך את המחקר של התפקוד שלהם ואת המבנה. בדומה RNAs ליניארי13, השימוש של מיניגנים הכתב מאפשר זיהוי של העמים וגורמים טרנס משחק המסדירים את היווצרות rnas מעגלית. לפיכך, גישה זו יוצרת השערות שניתן לבחון עוד יותר באמצעות הגנים האנדוגניים….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי משרד ההגנה משרד הביטחון מענק AZ180075. סטפן סטאם, תודה לז של ז’קלין נונן אנה פאולוצ’ין נתמכת על ידי ה-DAAD, התוכנית האקדמית הגרמנית, ג’סטין R. Welden היה מקבל את הפרס של אוניברסיטת קנטקי מקס סטקלר.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Tags

Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image