JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

We klonen en analyseren reporter genen die circulaire RNA’s genereren. Deze reporter genen zijn groter dan constructies om lineaire splicing te analyseren en Alu-elementen bevatten. Om de cirkelvormige RNAs te onderzoeken, worden de constructies omgezet in cellen en wordt resulterend RNA geanalyseerd met behulp van RT-PCR na verwijdering van lineair RNA.

Abstract

Naast lineaire mRNAs genereren veel eukaryotische genen circulaire RNA’s. De meeste circulaire RNAs worden gegenereerd door lid te worden van een 5 ‘splice site met een upstream 3 ‘ splice site binnen een pre-mRNA, een proces genaamd back-splicing. Deze circularisatie wordt waarschijnlijk geholpen door secundaire structuren in het pre-mRNA die de splice sites in de nabijheid brengen. In menselijke genen wordt gedacht dat Alu-elementen deze secundaire RNA-structuren bevorderen, omdat Alu-elementen overvloedig aanwezig zijn en basiscomplementariteiten met elkaar vertonen wanneer ze in tegengestelde richtingen aanwezig zijn in het pre-mRNA. Hier beschrijven we de generatie en analyse van grote, Alu-element met reportergenen die cirkelvormige RNA’s vormen. Door optimalisatie van kloonprotocollen kunnen reporter genen met een afstandslengte tot 20 kb worden gegenereerd. Hun analyse in co-transfection experimenten maakt het mogelijk de identificatie van regelgevende factoren. Zo kan deze methode identificeren RNA sequenties en cellulaire componenten die betrokken zijn bij cirkelvormige RNA vorming.

Introduction

Circulaire RNA’s
Circulaire RNAs (circRNAs) zijn covalently gesloten enkele gestrande RNAs die worden uitgedrukt in de meeste organismen. Ze worden gegenereerd door zich aan te sluiten bij een downstream 5′ splice site naar een upstream 3 ‘ splice site, een proces genaamd back-splicing (Figuur 1A)1. Sequenties in het pre-mRNA die basis complementair vertonen zo kort als 30-40 nt brengen back-splice sites in de juiste uitlijning voor circRNA vorming2. Bij de mens vormen Alu-elementen 1, die ongeveer 11% van het genoom3vertegenwoordigen , uitgebreide dubbelstrengs RNA-structuren in pre-mRNA vanwege hun zelfcomplementariteit4,5 en bevorderen zo de vorming van circRNAs1.

Momenteel zijn drie belangrijke functies van circRNAs beschreven. Sommige circRNAs binden microRNAs (miRNAs) en door sekwestratie fungeren als miRNA sponzen6. CircRNAs zijn betrokken bij transcriptie- en posttranscriptieregeling, door concurrentie met lineaire splicing7 of modulatie van transcriptiefactoractiviteit8. Ten slotte bevatten circRNAs korte open leeskaders en bewijzen van principestudies tonen aan dat ze kunnen worden vertaald9,10. De functie van de meeste circRNAs blijft echter raadselachtig. De meeste circulaire RNA’s zijn gedetecteerd met behulp van volgende generatie sequencing methoden11. Gedetailleerde analyses van individuele genen met behulp van gerichte RT-PCR benaderingen blijkt dat een groot aantal circulaire RNAs nog moet worden ontdekt12.

Gebruik van reporter genen om pre-mRNA verwerking te analyseren
De analyse van mRNA afgeleid van DNA reporter construeert transfected in cellen is een gevestigde methode om alternatieve pre-mRNA splicing te bestuderen, die kan worden toegepast op cirkelvormige RNAs. In het algemeen worden de alternatieve exon, de omringende intronen en constitutieve exonen versterkt en gekloond tot een eukaryotische expressievector. Vaak worden de introns ingekort. De constructies worden omgezet in eukaryotische cellen en meestal geanalyseerd door RT-PCR13,14. Deze aanpak is op grote schaal gebruikt om regelgevende splice-sites en trans-acting factoren in co-transfection experimenten13,15,16,17,18in kaart te brengen . Bovendien kon de productie van eiwituitdrukkende minigenen worden gescreend op stoffen die alternatieve splicing19,20veranderen .

De methode is toegepast op circulaire RNA’s. Momenteel zijn ten minste 12 minigene backbones beschreven in de literatuur en samengevat in tabel 1. Met uitzondering van het op tRNA gebaseerde expressiesysteem21,22zijn ze allemaal afhankelijk van polymerase II-promotors. Hier beschrijven we een methode om menselijke reporter minigenen te genereren om cis en trans-acting factoren die betrokken zijn bij de generatie van circulaire RNAs te bepalen. Een overzicht van de methode met behulp van sequenties van een gepubliceerd reporter gen23 is te zien in figuur 1.

Protocol

1. Ontwerp van de constructies Gebruik de UCSC genoombrowser24 om repetitieve elementen te identificeren die nodig zijn voor cirkelvormige RNA-vorming en deze op te nemen in de constructies. Belangrijk is dat primers voor versterking buiten de repetitieve elementen moeten zijn. Plak de cirkelvormige RNA-sequentie(Supplemental Figuur 1 is een testsequentie) in https://genome.ucsc.edu/…

Representative Results

Reporter genen maken bepaling van regelgevende factoren die van invloed zijn op circulaire RNA vorming. Echter, deze reporter genen zijn groot en bevatten repetitieve elementen die vaak DNA-constructies instabiel. Vanwege hun grote omvang is het vaak noodzakelijk om delen van de introns te verwijderen, wat wordt bereikt door het versterken van genomische stukken met de exonen en kleinere flankerende intronic-delen. Deze DNA-stukken zijn enzymatisch geassembleerd, waardoor de bouw zonder beperking enzymen. <p class="j…

Discussion

In het algemeen, cirkelvormige RNA’s zijn laag overvloedig1, die de studie van hun functie en vorming compliceert. Net als bij lineaire RNAs13,maakt het gebruik van reporter minigenes de identificatie van cis en trans-acting factoren die de vorming van cirkelvormige RNAs reguleren. Deze aanpak genereert dus hypothesen die verder kunnen worden getest met behulp van de endogene genen.

De meest kritische stap is het ontwerp van het reporter gen. De …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie DoD subsidie AZ180075. Stefan Stamm bedankt Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin werd ondersteund door de DAAD, Duitse academische uitwisseling programma, Justin R. Welden was een ontvanger van de Universiteit van Kentucky Max Steckler Award.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Tags

Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image