Митохондрии и эндоплазмические ретикулами imaging коррелятийным светом и объемной электронной микроскопией

Митохондрии и эндоплазмический ретикулум (ER) являются мембранными клеточными органеллами. Их связь необходима для их функции, и белки, связанные с их сетью, были описаны¹. Расстояние между митохондриями и ER было сообщено как приблизительно 100 nm используя световую микроскопию^2; однако, недавние супер-разрешение микроскопии³ и электронной микроскопии (EM)⁴ исследования показали, что он будет значительно меньше, примерно на 10-25 нм. Разрешение, достигнутое в микроскопии супер-разрешения ниже, чем EM, и требуется специальная маркировка. EM является подходящим методом для достижения достаточно высокого разрешения контраста для структурных исследований связей между митохондриями и ER. Однако недостатком является ограниченная информация z-оси, поскольку тонкие секции должны быть примерно на 60 нм или тоньше для обычной электронной микроскопии передачи (TEM). Для достаточного изображения EM z-оси можно использовать трехмерную электронную микроскопию (3DEM). Однако это предполагает подготовку сотен тонких серийных секций целых клеток, что очень сложно сделать, что освоили лишь немногие опытные технологи. Эти тонкие секции собраны на хрупких formvar пленки покрытием одноотверстие TEM сетки. Если пленка ломается на одном поясе, серийная визуализация и реконструкция громкости невозможны. Серийный блок-лицо сканирования электронной микроскопии (SBEM) является популярным методом для 3DEM, который использует разрушительные en блок секции внутри сканирующего электронного микроскопа (SEM) вакуумной камеры либо с алмазным ножом (Dik-SBEM) или целенаправленной ионный луч (FIB-SEM) ⁶. Однако, поскольку эти методы не доступны на всех объектах, мы предлагаем массив томографии⁷ с использованием последовательного секции и SEM. В массивной томографии серийные секции, вырезанные с помощью ультрамикротома, переносятся на стеклянный покрывало вместо сетки TEM и визуализируются с помощью световой микроскопии и SEM^8. Для повышения сигнала для backscatter электрона (BSE) изображения, мы использовали ан блок EM окрашивания протокола с использованием осмия тетрокида (OsO₄) фиксированные клетки с osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH)⁹, что позволяет нам получать изображения без после встраивания двойное окрашивание.

Кроме того, митохондриальный маркер SCO1 (цитохром c окислидаса сборки белка 1) – аскорбат переоксидазы 2 (APEX2)¹⁰ молекулярный тег был использован для визуализации митохондрий на уровне ЭМ. APEX2 составляет около 28 kDa и является производным от сои аскорбат перекиснидаза¹¹. Он был разработан, чтобы показать подробное расположение конкретных белков на уровне EM таким же образом, что зеленый флуоресцентный белок помечены белка используется в световой микроскопии. APEX2 преобразует 3,3′ -диаминобензидин (DAB) в нерастворимый осмиофильный полимер в месте тега в присутствии кофакторного перекиси водорода (H₂O₂). APEX2 может быть использован в качестве альтернативы традиционной маркировки антител в EM, с локализацией белка на всей глубине всей клетки. Другими словами, белок с маркировкой APEX2 может быть визуализирован специфическим осмицией¹¹ без маркировки иммуногольдов и пермяки после ультракриосекции. Хрендиш пероксидаза (HRP) также чувствительный тег, который катализирует H₂O 2-зависимых полимеризации DAB в локализованный осадок, обеспечивая EM контраст после лечения с OsO₄. ER целевой пептид последовательности HRP-KDEL (лис-асп-глу-лей)¹² был применен для визуализации ER в рамках всей клетки. Для оценки нашего протокола использования генетических тегов и окрашивания ан блока с уменьшенным осмием и TCH (метод ROTO), используя эффект осмии в то же время, мы сравнили мембранный контраст с и без использования каждой генетической метки в rOTO ан блок окрашивания. Хотя 3DEM с массивом томографии и DAB окрашивания с APEX и HRP, соответственно, были использованы для других целей, наш протокол уникален, потому что мы объединили массив томографии для 3DEM и DAB окрашивания для митохондрий и ER маркировки. В частности, мы показали пять клеток с и без APEX помечены генов в том же разделе, который помогал в исследовании влияния генетической модификации на клетки.