Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

I mitocondri e i reticoli endolasmici (ER) sono organelli cellulari legati alla membrana. La loro connessione è necessaria per la loro funzione, e le proteine legate alla loro rete sono state descritte¹. La distanza tra i mitocondri e il ER è stata riportata come circa 100 nm utilizzando la microscopia luminosa²; tuttavia, recenti studi di microscopia a super-risoluzione³ ed elettroscopia (EM)⁴ hanno rivelato che è notevolmente più piccolo, a circa 10-25 nm. La risoluzione raggiunta nella microscopia a super-risoluzione è inferiore a EM ed è necessaria un’etichettatura specifica. EM è una tecnica adatta per ottenere un contrasto sufficientemente ad alta risoluzione per gli studi strutturali delle connessioni tra mitocondri e ER. Tuttavia, uno svantaggio è rappresentato dalle informazioni limitate sull’asse z, in quanto le sezioni sottili devono essere di circa 60 nm o più sottili per la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale (TEM). Per una sufficiente imaging dell’asse z EM, è possibile utilizzare la microscopia elettronica tridimensionale (3DEM)⁵. Tuttavia, questo comporta la preparazione di centinaia di sottili sezioni seriali di intere cellule, che è un lavoro molto difficile che solo pochi tecnologi qualificati hanno imparato. Queste sezioni sottili vengono raccolte su griglie TEM a foro rivestite con pellicola di forma fragile. Se il film si rompe su una cintura, l’imaging seriale e la ricostruzione del volume non sono possibili. La microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi (SBEM) è una tecnica popolare per 3DEM che utilizza la sezionamento distruttivo del blocco all’interno della camera a vuoto del microscopio elettronico a scansione (SEM) con un coltello a diamante (Dik-SBEM) o un fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) ⁶. Tuttavia, poiché tali tecniche non sono disponibili in tutte le strutture, suggeriamo la tomografia array⁷ utilizzando il sezionamento seriale e SEM. Nella tomografia a matrice, le sezioni seriali tagliate con un ultramicrotoma vengono trasferite su una vetrina di vetro invece di una griglia TEM e visualizzate tramite microscopia leggera e SEM⁸. Per migliorare il segnale per l’imaging di elettroni backscatter (BSE), abbiamo utilizzato un protocollo di colorazioneen bloc EM che impiega cellule fisse osmioum tetrossido (OsO 4) con thiocarbohydrazide (TCH)⁹osmiofilia doppia colorazione post-incorporamento.

Inoltre, il marcatore mitocondriale SCO1 (proteina di assemblaggio citocromatico c ossidasi 1)– ascorbate peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ tag molecolare è stato utilizzato per visualizzare i mitocondri a livello di EM. APEX2 è di circa 28 kDa ed è derivato da soia ascorbate perossidasi¹¹. È stato sviluppato per mostrare la posizione dettagliata di proteine specifiche a livello EM nello stesso modo in cui la proteina con etichettatura proteica fluorescente verde viene utilizzata nella microscopia leggera. APEX2 converte 3,3′ -diaminobenzidina (DAB) in un polimero osmiofilo insolubile nel sito del tag in presenza del cofattore di perossido di idrogeno (H₂O₂). APEX2 può essere utilizzato come alternativa all’etichettatura tradizionale degli anticorpi in EM, con una localizzazione delle proteine per tutta la profondità dell’intera cellula. In altre parole, la proteina con etichetta APEX2 può essere visualizzata mediante osmicazione specifica¹¹ senza etichettatura immunogold e permeabilizzazione dopo l’ultracriosezione. La perossidasi di rafano (HRP) è anche un tag sensibile che catalizza la polimerizzazione dipendente da DAB H₂O₂in un precipitato localizzato, fornendo contrasto EM dopo il trattamento con OsO₄. La sequenza di peptidi bersaglio ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² è stata applicata per visualizzare ER all’interno di un’intera cellula. Per valutare il nostro protocollo di utilizzo di tag genetici e di attenuazione in blocco con osmio ridotto e TCH (metodo rOTO), utilizzando l’effetto osmicazione allo stesso tempo, abbiamo confrontato il contrasto della membrana con e senza l’uso di ogni tag genetico in rOTO en bloc colorazione. Anche se 3DEM con tomografia array e colorazione DAB con APEX e HRP sono stati, rispettivamente, utilizzati per altri scopi, il nostro protocollo è unico perché abbiamo combinato la tomografia di array per la colorazione 3DEM e DAB per la colorazione dei mitocondri e del ER. In particolare, abbiamo mostrato cinque cellule con e senza geni etichettati con APEX nella stessa sezione, il che ha aiutato a studiare l’effetto della modificazione genetica sulle cellule.