Summary

Amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation d'blastema de mammifères et l'ossification intramembrane

Published: July 12, 2019
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole de l’amputation de phalange terminale de souris adulte pour étudier la formation de blastma de mammifères et l’ossification intramembrane, analysée par l’immunohistochemistry fluorescent et la tomographie microcomputed in-vivo séquentielle.

Abstract

Ici, nous présentons un protocole de la phalange terminale adulte de souris (P3) amputation, un modèle mammifère procéduralement simple et reproductible de régénération épimorphe, qui implique la formation de blastma et l’ossification intramembrane analysée par immunohistochemistry de fluorescence et tomographie microcomputée in vivo séquentielle (CT). La régénération des mammifères est limitée aux amputations transectant la région distale de la phalange terminale (P3); les chiffres amputés à des niveaux plus proximal s’échouent et subissent la guérison fibrotique et la formation de cicatrices. La réponse de régénération est médiée par la formation d’un blastème proliférant, suivi de la régénération d’os par l’ossification intramembrane pour reconstituer la longueur squelettique amputée. L’amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique chez les mammifères, et est un outil puissant pour la conception des stratégies thérapeutiques pour remplacer la guérison fibrotique par une réponse régénérative réussie. Notre protocole utilise l’immunohistochimie de fluorescence pour 1) identifier les populations tôt et tard de cellules de blastma, 2) la revascularisation d’étude dans le contexte de la régénération, et 3) étudier l’ossification intramembrane sans avoir besoin d’os complexe dispositifs de stabilisation. Nous démontrons également l’utilisation de l’in vivo séquentiel pour créer des images haute résolution pour examiner les changements morphologiques après l’amputation, ainsi que pour quantifier les changements de volume et de longueur dans le même chiffre au cours de la régénération. Nous croyons que ce protocole offre une utilité énorme pour étudier les réponses épimorphiques et régénératrices tissulaires chez les mammifères.

Introduction

Les mammifères, y compris les humains et les souris, ont la capacité de régénérer les pointes de leurs chiffres après l’amputation distale de la phalange terminale (P3)1,2,3. Chez la souris, la réponse de régénération est dépendante de l’amputation; les amputations de chiffre de plus en plus proximales affichent une réponse régénérative progressivement atténuée jusqu’à l’échec régénératif complet aux amputations transectant et proximal à la matrice d’ongle de P34,5,6 , 7 Annonces , 8. La régénération de P3 est médiée par la formation d’un blastma, défini comme une population de cellules proliférantes qui subissent la morphogénèse pour régénérer les structures amputées9. La formation d’un blastma pour régénérer les structures perdues par amputation, un processus appelé régénération épimorphe, distingue la réponse de régénération P3 multi-tissu-niveau de la réparation traditionnelle de tissu après blessure6, 10. La régénération de P3 est un modèle reproductible et procéduralement simple pour étudier les processus régénératifs complexes comprenant la guérison de blessure11,12, histolyse d’os11,12, revascularisation13, régénération nerveuse périphérique14, et conversion blastmalà l’os par ossification intramembrane1 .

Des études antérieures utilisant l’immunohistochimie ont démontré que le blastema est hétérogène, avascular, hypoxique, et fortement proliférant11,13,15,16. Après l’amputation distale de P3, le blastema tôt est au commencement associé au périosteum et à l’endosteum de P3 et est caractérisé par la prolifération robuste et l’ostéogenèse naissante adjacente à la surface d’os15. Après la dégradation d’os et la fermeture de blessure, le blastma hétérogène est formé par la fusion des cellules periosteal et endosteal-associées, suivie par la différenciation des composants blastmal comprenant l’os par l’ossification intramembrane 15.

La réparation osseuse en réponse à des blessures se produit généralement par ossification endochondrale, c’est-à-dire par l’intermédiaire d’un callus cartilagineux initial qui forme un modèle pour la formation osseuse ultérieure17,18. L’ossification intramembrane à long os, c.-à-d., formation d’os sans intermédiaire cartilagineux, est généralement induite utilisant des dispositifs complexes de distraction ou la fixation chirurgicale19,20. La réponse de régénération de chiffre est un modèle préclinique qui offre des avantages au-dessus des modèles conventionnels d’ossification intramembrane : 1) il n’exige pas la blessure externe ou interne de poteau de fixation pour stimuler l’ossification intramembrane, 2) il est réalisée à l’aide de 4 chiffres de chaque animal, maximisant ainsi les échantillons tout en minimisant l’utilisation des animaux, et 3) l’analyse de la tomographie microcomputée in vivo séquentielle peut être effectuée avec facilité et rapidité.

Dans la présente étude, nous montrons le plan standardisé d’amputation de P3 pour réaliser une réponse reproductible et robuste de régénération. En outre, nous démontrons un protocole optimisé d’immunohistochemistry de fluorescence utilisant des sections de paraffine pour visualiser la formation de blastma, la revascularisation dans le contexte de la régénération, et la conversion blastmal à l’os par l’intermédiaire intramembranous Ossification. Nous démontrons également l’utilisation de l’invivo séquentiel pour identifier des changements dans la morphologie, le volume, et la longueur d’os dans le même chiffre au cours de la régénération. L’objectif de ce protocole est d’étudier la formation de blastma mammifère après l’amputation et de démontrer 2 techniques, l’immunohistochemistry de fluorescence et le TCT in vivo séquentiel, pour l’étude de la régénération osseuse intramembrane.

Protocol

Toutes les techniques et l’utilisation des animaux étaient conformes aux procédures d’exploitation standard du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Texas A et M. 1. Adulte Souris Hind Limb Distal P3 Amputation Anesthésiez une souris CD-1 de 8 à 12 semaines (Tableaudes matériaux)en utilisant du gaz isoflurane dans l’oxygène; d’abord anesthésier à 3% dans une chambre, suivie de 2% isoflurane fourni par un cône de nez su…

Representative Results

La souris adulte régénérant des chiffres P3 à 6/7 DPA (Figure 2A-D), 9 DPA (Figure 2E-H), et 10 DPA (Figure 2I-L) ont été immunostained avec des anticorps à Runx2, OSX, et PCNA pour visualiser l’os intramembrane la régénération, et immunostained avec des anticorps à CXCR4 et vWF pour visualiser la formation de blastma. Les rendus représentatifs de la CT des chiffres num?…

Discussion

Ce protocole décrit une procédure normalisée de l’amputation distale de P3 de souris adulte, de la coloration immunohistochemical fluorescente pour visualiser et étudier la formation de blastma et l’ossification intramembrane, et le balayage in-vivo séquentieux de CT à identifier les changements morphologiques, de volume et de longueur d’os après l’amputation. L’amputation de P3 est un modèle unique, procéduralement simple, et reproductible pour analyser un environnement pro-régénératif de blessure qui décle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du Laboratoire Muneoka et du Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Ce travail a été soutenu par l’Université texasA et M.

Materials

Protein Block Serum Free DAKO X0909 Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody Abcam ab29 1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody R&D Systems MAB21651 1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody DAKO A0082 1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody Abcam ab22552 1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody Sigma-Aldrich Co. HPA022040 1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A21235 1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11008 1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077 1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Ready to use
Surgipath Decalicifier 1 Leica Biosystems 3800400 Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative Anatech LTD 174 Ready to use
CD-1 Female Mouse Envigo ICR(CD-1) 8-12-weeks-old
vivaCT 40 SCANCO Medical

References

  1. Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
  2. Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
  3. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  4. Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
  5. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. 发育生物学. 315, 125-135 (2008).
  6. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  7. Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
  8. Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
  9. Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. 发育生物学. 433, 190-199 (2018).
  10. Carlson, B. M. . Principles of Regenerative Biology. , (2007).
  11. Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. 发育生物学. 350, 301-310 (2011).
  12. Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
  13. Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
  14. Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. 发育生物学. 445, 237-244 (2018).
  15. Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
  16. Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
  17. Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
  18. Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
  19. Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
  20. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
  21. Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
  22. Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. 发育生物学. 382, 98-109 (2013).
  23. Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).

Play Video

Cite This Article
Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, K. N., Qureshi, O., Falck, A. R., Kim, P., Dolan, C. P., Yu, L., Lin, Y., Daniel, B., Yan, M., Muneoka, K. Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification. J. Vis. Exp. (149), e59749, doi:10.3791/59749 (2019).

View Video