In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

I neuroni sono per la maggior parte post-mitotici e incapaci di dividere^1,2. Nella maggior parte degli animali, esistono meccanismi neuroprotettivi per mantenere queste cellule per tutta la durata della vita dell’organismo, soprattutto in età avanzata quando i neuroni sono più vulnerabili ai danni. I geni alla base di questi meccanismi possono essere identificati in mutanti che presentano neurodegenerazione, un indicatore fenotipipico per la perdita di neuroprotezione, utilizzando un protocollo genetico in avanti. Gli schermi genetici in avanti che utilizzano mutageni chimici come il metaesonte etilare (EMS) o N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) sono particolarmente utili a causa delle mutazioni casuali che inducono, con conseguente un approccio intrinsecamente imparziale che ha fatto luce numerose funzioni geniche negli organismi del modello eucariotico^3,4,5 (al contrario, la mutagenesi a raggi X crea rotture del DNA e può provocare riarrangiamento piuttosto che mutazioni puntiformi⁶).

Il comune filo della frutta Drosophila melanogaster è un soggetto ideale per questi schermi grazie alla sua alta qualità, sequenza genomica ben annotata, la sua lunga storia come organismo modello con strumenti genetici altamente sviluppati, e più significativamente, la sua comune storia evolutiva con gli esseri umani^7,8. Un fattore limitante nell’applicabilità di questo protocollo è la letalità precoce causata dai geni mutati, che impedirebbe i test ai⁹anni . Tuttavia, per le mutazioni non letali, un saggio di arrampicata, che sfrutta il geotassi negativo, è un metodo semplice, anche se esteso, per quantificare il funzionamento motorio alterato¹⁰. Per mostrare una sufficiente reattività locomotoria, le mosche dipendono dalle funzioni neurali per determinare la direzione, percepire la sua posizione e coordinare il movimento. L’incapacità delle mosche di salire sufficientemente in risposta agli stimoli può quindi indicare difetti neurologici¹¹. Una volta identificato un particolare fenotipo dell’arrampicata difettosa, ulteriori test utilizzando uno schermo secondario come l’analisi istologica del tessuto cerebrale, possono essere utilizzati per identificare la neurodegenerazione nelle mosche difettose dell’arrampicata. La successiva mappatura genica può quindi essere utilizzata per rivelare la regione genomica sul cromosoma che porta il gene neuroprotettivo difettoso di interesse. Per restringere la regione cromosomica di interesse, è possibile eseguire la mappatura meiotica utilizzando linee di mosca mutanti che trasportano geni marcatori dominanti con posizioni note sul cromosoma. I geni marcatori fungono da punto di riferimento per la mutazione, poiché la frequenza di ricombinazione tra due loci fornisce una distanza misurabile che può essere utilizzata per mappare la posizione approssimativa di un gene. Infine, l’attraversamento delle linee mutanti con linee che trasportano carenze equilibrate sulla regione cromosomica meioticamente mappata crea un test di complemento in cui il gene di interesse può essere verificato se il suo fenotipo noto è espresso⁵. Le sequenze di nucleotidi polimorfici nel gene identificato, eventualmente risultanti in sequenze di amminoacidi alterate, possono essere valutate sequenziando il gene e confrontandolo con la sequenza del genoma della Drosophila. La successiva caratterizzazione del gene di interesse può includere test di ulteriori alleli mutanti, esperimenti di salvataggio delle mutazioni e l’esame di fenotipi aggiuntivi.