ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster
Summary
אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.
Abstract
יש הרבה מה להבין על התחלתה והתקדמות של מחלות ניווניות, כולל הגנים הבסיסיים האחראים. הקרנה גנטית קדימה באמצעות מוטגנים כימיים היא אסטרטגיה שימושית עבור מיפוי פנוטיפים מוטנטים לגנים בקרב דרוזופילה ואורגניזמים אחרים של מודל החולקים מסלולים סלולריים שמרו עם בני אדם. אם גן העניין המוטציה אינו קטלני בשלבים התפתחותיים מוקדמים של זבובים, ניתן לנהל שיטת טיפוס על המסך עבור אינדיקטורים פנופי של תפקוד מוחי מופחת, כגון שיעורי טיפוס נמוכים. לאחר מכן, ניתוח היסטולוגית משנית של רקמת המוח ניתן לבצע על מנת לאמת את תפקוד נוירוגני של הגן על ידי הבקיע פנוטיפים נוירוניוון. אסטרטגיות מיפוי גנטי כוללות meiotic ומיפוי מחסור המסתמכים על אותו בחני שיכול להיות ואחריו ברצף DNA כדי לזהות שינויים של נוקלאוטיד אפשרי בגנים של עניין.
Introduction
נוירונים הם עבור החלק ביותר post-mitotic ולא מסוגל לחילוק1,2. ברוב החיות, מנגנוני הגנה מפני המוח קיימים כדי לשמור על תאים אלה במהלך תוחלת החיים של האורגניזם, במיוחד בגיל הזקנה כאשר הנוירונים פגיעים ביותר לנזק. גנים המשמשים את המנגנונים האלה ניתן לזהות במוטציות המציגות ניוון, מחוון גמישות פנוטיפית לאובדן הגנה עצבית, באמצעות פרוטוקול גנטי קדמי. המסכים הגנטיים הקדמיים באמצעות מוטגנים כימיים כגון אתיל מתיונין (EMS) או N-אתיל-N-ניטרוגליצרין (אנו) שימושיים במיוחד בשל מוטציות בנקודה אקראית שהם לגרום, וכתוצאה מכך גישה משוחדת מטבעו כי יש לשפוך אור על מספר רב של פונקציות גנים באורגניזמים המודל איקריוטית3,4,5 (לעומת זאת, X-ray מוטאנזיס יוצר הפסקות DNA ויכול לגרום לסידור מחדש ולא מוטציות נקודה6).
זבוב הפירות הנפוץ דרוסופילה מלאנוסטר הוא נושא אידיאלי עבור מסכים אלה בשל איכות גבוהה, רצף הגנום מסומן היטב, ההיסטוריה הארוכה שלה כאורגניזם מודל עם כלים גנטיים מפותחים מאוד, ומשמעותית ביותר, משותף שלה היסטוריה אבולוציונית עם בני אדם7,8. גורם מגביל בתחולתה של פרוטוקול זה הוא מוקדם מאוד שנגרם על ידי הגנים מוטציה, אשר ימנע בדיקה בגיל הזקנה9. עם זאת, עבור מוטציות שאינן קטלניות, שיטת טיפוס, אשר מנצלת מוניות גאו שליליות, היא פשוטה, למרות נרחב, שיטה של ככמת לקויי התפקוד מנוע10. כדי להפגין הlocomotor פעילות מספקת, זבובים תלויים בפונקציות עצביות כדי לקבוע כיוון, לחוש את מיקומו ולתאם תנועה. חוסר היכולת של זבובים לטפס מספיק בתגובה לגירויים יכול אפוא להצביע על פגמים נוירולוגיים11. פעם אחת הפנוטיפ פגום הטיפוס מזוהה, בדיקות נוספות באמצעות מסך משני כגון ניתוח היסטולוגית של רקמת המוח, ניתן להשתמש כדי לזהות ניוון נוירוטים בתוך הטיפוס, זבובים פגומים. מיפוי הגנים הבאים ניתן להשתמש כדי לחשוף את האזור גנומית על כרומוזום נושאת את הגן פגום המגן של ריבית. כדי לצמצם את האזור הכרומוזומים של עניין, מיפוי meiotic באמצעות שורות לטוס מוטציה נושאת גנים סמן דומיננטי עם מיקומים ידועים על כרומוזום ניתן לבצע. גנים סמן לשמש נקודת התייחסות המוטציה כתדירות של שילוב מחדש בין שני המקום מספק מרחק מדיד שניתן להשתמש בו כדי למפות את המיקום המשוער של הגן. בסופו של דבר, חציית קווי המוטציות עם קווים הכוללים ליקויים מאוזנים על אזור כרומוזום ממופה ממופים של עניין יוצר מבחן מלא שבו הגן של עניין יכול להיות מאומת אם הפנוטיפ הידוע שלה מתבטא5. פולימורית מנוונת רצפי הגאות בגנים מזוהה, אולי כתוצאה מכך רצפי חומצות אמינו שהשתנו, ניתן להעריך על ידי רצף הגנים והשוואת אותו לרצף הגנום Drosophila ילה . האפיון הבאים של גן העניין יכול לכלול בדיקות של alleles מוטציות הצלה ניסויים ובדיקה של פנוטיפים נוספים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המסכים הגנטיים הקדמיים בדרוזוהילה מהווה גישה אפקטיבית לזיהוי גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל הגנה מפני גיל5,23,24, 25. באמצעות אסטרטגיה זו, היינו מצליחים לזהות פרחח כמו גן נוירוגני הרומן17</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה במיוחד לד ר בארי גאנצקי, במעבדה של מי המסך הגנטי בוצע, המאפשר זיהוי ואפיון של פרחח כמו גן נוירוגני. אנו מודים לד ר סטיבן רובינוב באדיבות לספק את האוסף של הזבובים של אנו-מוטייזד המשמשים במסך הגנטי המוצג במאמר זה. אנו מודים לחברי מעבדת גנצקי, ד”ר גרייס בוהוף-פלק ודוד ווסטמן לדיונים מועילים במהלך הפרויקט, לינג לינג הו ובוב קרבר לסיוע טכני, ד ר אקי אישידה לשימוש במתקן המיקרוטום שלו ב אוניברסיטת ויסקונסין וד ר קים לאקי והמכון לאנליזה אופטית באוניברסיטת אלבמה.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. 遗传学. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. 遗传学. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. 遗传学. 161 (3), 1197-1208 (2002).
