Summary

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

Published: July 11, 2019
doi:

Summary

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.

Abstract

יש הרבה מה להבין על התחלתה והתקדמות של מחלות ניווניות, כולל הגנים הבסיסיים האחראים. הקרנה גנטית קדימה באמצעות מוטגנים כימיים היא אסטרטגיה שימושית עבור מיפוי פנוטיפים מוטנטים לגנים בקרב דרוזופילה ואורגניזמים אחרים של מודל החולקים מסלולים סלולריים שמרו עם בני אדם. אם גן העניין המוטציה אינו קטלני בשלבים התפתחותיים מוקדמים של זבובים, ניתן לנהל שיטת טיפוס על המסך עבור אינדיקטורים פנופי של תפקוד מוחי מופחת, כגון שיעורי טיפוס נמוכים. לאחר מכן, ניתוח היסטולוגית משנית של רקמת המוח ניתן לבצע על מנת לאמת את תפקוד נוירוגני של הגן על ידי הבקיע פנוטיפים נוירוניוון. אסטרטגיות מיפוי גנטי כוללות meiotic ומיפוי מחסור המסתמכים על אותו בחני שיכול להיות ואחריו ברצף DNA כדי לזהות שינויים של נוקלאוטיד אפשרי בגנים של עניין.

Introduction

נוירונים הם עבור החלק ביותר post-mitotic ולא מסוגל לחילוק1,2. ברוב החיות, מנגנוני הגנה מפני המוח קיימים כדי לשמור על תאים אלה במהלך תוחלת החיים של האורגניזם, במיוחד בגיל הזקנה כאשר הנוירונים פגיעים ביותר לנזק. גנים המשמשים את המנגנונים האלה ניתן לזהות במוטציות המציגות ניוון, מחוון גמישות פנוטיפית לאובדן הגנה עצבית, באמצעות פרוטוקול גנטי קדמי. המסכים הגנטיים הקדמיים באמצעות מוטגנים כימיים כגון אתיל מתיונין (EMS) או N-אתיל-N-ניטרוגליצרין (אנו) שימושיים במיוחד בשל מוטציות בנקודה אקראית שהם לגרום, וכתוצאה מכך גישה משוחדת מטבעו כי יש לשפוך אור על מספר רב של פונקציות גנים באורגניזמים המודל איקריוטית3,4,5 (לעומת זאת, X-ray מוטאנזיס יוצר הפסקות DNA ויכול לגרום לסידור מחדש ולא מוטציות נקודה6).

זבוב הפירות הנפוץ דרוסופילה מלאנוסטר הוא נושא אידיאלי עבור מסכים אלה בשל איכות גבוהה, רצף הגנום מסומן היטב, ההיסטוריה הארוכה שלה כאורגניזם מודל עם כלים גנטיים מפותחים מאוד, ומשמעותית ביותר, משותף שלה היסטוריה אבולוציונית עם בני אדם7,8. גורם מגביל בתחולתה של פרוטוקול זה הוא מוקדם מאוד שנגרם על ידי הגנים מוטציה, אשר ימנע בדיקה בגיל הזקנה9. עם זאת, עבור מוטציות שאינן קטלניות, שיטת טיפוס, אשר מנצלת מוניות גאו שליליות, היא פשוטה, למרות נרחב, שיטה של ככמת לקויי התפקוד מנוע10. כדי להפגין הlocomotor פעילות מספקת, זבובים תלויים בפונקציות עצביות כדי לקבוע כיוון, לחוש את מיקומו ולתאם תנועה. חוסר היכולת של זבובים לטפס מספיק בתגובה לגירויים יכול אפוא להצביע על פגמים נוירולוגיים11. פעם אחת הפנוטיפ פגום הטיפוס מזוהה, בדיקות נוספות באמצעות מסך משני כגון ניתוח היסטולוגית של רקמת המוח, ניתן להשתמש כדי לזהות ניוון נוירוטים בתוך הטיפוס, זבובים פגומים. מיפוי הגנים הבאים ניתן להשתמש כדי לחשוף את האזור גנומית על כרומוזום נושאת את הגן פגום המגן של ריבית. כדי לצמצם את האזור הכרומוזומים של עניין, מיפוי meiotic באמצעות שורות לטוס מוטציה נושאת גנים סמן דומיננטי עם מיקומים ידועים על כרומוזום ניתן לבצע. גנים סמן לשמש נקודת התייחסות המוטציה כתדירות של שילוב מחדש בין שני המקום מספק מרחק מדיד שניתן להשתמש בו כדי למפות את המיקום המשוער של הגן. בסופו של דבר, חציית קווי המוטציות עם קווים הכוללים ליקויים מאוזנים על אזור כרומוזום ממופה ממופים של עניין יוצר מבחן מלא שבו הגן של עניין יכול להיות מאומת אם הפנוטיפ הידוע שלה מתבטא5. פולימורית מנוונת רצפי הגאות בגנים מזוהה, אולי כתוצאה מכך רצפי חומצות אמינו שהשתנו, ניתן להעריך על ידי רצף הגנים והשוואת אותו לרצף הגנום Drosophila ילה . האפיון הבאים של גן העניין יכול לכלול בדיקות של alleles מוטציות הצלה ניסויים ובדיקה של פנוטיפים נוספים.

Protocol

1. הכנה והזדקנות זבובים השג או צור6 אוסף של מוטציות דרוזופילה שישמשו עבור המסך הגנטי. כאן, הקווים אנו-מוטזזזד ממופה הכרומוזום השני ומאוזנת על Cyo משמשים. ההגביר את קווי הגנוטיפ הניסיוניים בחממה שנקבעה ב -25 ° c, 12 h מחזור אור/כהה על מדיום קמח-מולסה. לאסוף סב?…

Representative Results

ב aerticle זה, אנו מציגים את הצעדים המשמשים כדי לזהות את הגידול המוח גנטי (פרחח) כמו לשחק תפקיד תחזוקה של שלמות עצבית (למשל, הגנה מפני העצבים) ב למבוגרים זבובים17; מתודולוגיה שיכולה לשמש לזיהוי גנים המעורבים בהגנה עצבית. השתמשנו בגישה גנטית מקדימה (האסטרט…

Discussion

המסכים הגנטיים הקדמיים בדרוזוהילה מהווה גישה אפקטיבית לזיהוי גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל הגנה מפני גיל5,23,24, 25. באמצעות אסטרטגיה זו, היינו מצליחים לזהות פרחח כמו גן נוירוגני הרומן17</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו אסירי תודה במיוחד לד ר בארי גאנצקי, במעבדה של מי המסך הגנטי בוצע, המאפשר זיהוי ואפיון של פרחח כמו גן נוירוגני. אנו מודים לד ר סטיבן רובינוב באדיבות לספק את האוסף של הזבובים של אנו-מוטייזד המשמשים במסך הגנטי המוצג במאמר זה. אנו מודים לחברי מעבדת גנצקי, ד”ר גרייס בוהוף-פלק ודוד ווסטמן לדיונים מועילים במהלך הפרויקט, לינג לינג הו ובוב קרבר לסיוע טכני, ד ר אקי אישידה לשימוש במתקן המיקרוטום שלו ב אוניברסיטת ויסקונסין וד ר קים לאקי והמכון לאנליזה אופטית באוניברסיטת אלבמה.

Materials

Major equipment
Fume hood for histology
Light Microscope Nikon Eclipe E100 Preferred objective for imaging is X20
Imaging software Nikon
Microscope Camera Nikon
Thermal cycler Eppendorf
Fly pushing and climbing assay
VWR® Drosophila Vial, Narrow VWR 75813-160
VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-912
Standard mouse pad
Stereoscope Motic Model SMZ-168
CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) Genesee Scientific 54-104, 59-121, 59-172 Doesn’t iinclude CO2 tank
Fine-Tip Brushes SOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila Incubator VWR 89510-750
Gene mapping
CantonS Bloomington Drosophila Stock Center 9517
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 5905
yw  Bloomington Drosophila Stock Center 6599
Drosophila line used for recombination mapping Bloomington Drosophila Stock Center 3227 Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco]  Bloomington Drosophila Stock Center 2555 Drosophila balancer line used for recombination mapping
Deficiency Kit for chromosome 2L Bloomington Drosophila Stock Center DK2L Cook et al., 2012
Histology analysis
Ethanol, (100%) Thermo Fischer Scientific A4094
Chloroform Thermo Fischer Scientific C298-500
Glacial Acetic Acid Thermo Fischer Scientific A38-500
Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Thermo Fischer Scientific 05-408-129
Histochoice clearing agent 1X VWR Life Sciences 97060-934
Harris Hematoxylin VWR 95057-858
Eosin VWR 95057-848
Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium Thermo Scientific™ 4112 22-110-610 CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus Azer Scientific
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles Fisherbrand 12-545M Dimensions: 24×60 mm
Traceable timer VWR
Slide Warmer Barnstead International model no. 26025
Slide tray and racks DWK Life Sciences Rack to hold 20 slides
Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps Fisherbrand 10-316A
Kimwipes™ Kimberly-Clark™ Professional 
6 inch Puritan applicators Hardwood Products Company, Guilford, Maine 807-12
VWR® Razor Blades VWR 55411-050
Tupperware or glass containers for histology liquids 16 + 1 for running water
High Profile Coated Microtome Blades VWR 95057-834
Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L Corning™
Beaker Or other container for ice water and cassettes
Tissue Bath Precision Scientific Company 66630
Microtome Leica Biosystems
Molecular analysis
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
Ex Taq DNA polymerase TaKaRa 5 U/μl
Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain   Invitrogen™
UltraPure™ Agarose  Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder  Invitrogen™
ApE-A plasmid Editor software Available for free download
Statistical analysis
R software package
Further analysis
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] Bloomington Drosophila Stock Center 59967

References

  1. Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
  2. Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
  3. Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
  4. Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  7. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  8. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  10. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  11. Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
  12. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  13. R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  14. Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
  15. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
  16. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
  17. Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
  18. Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. 遗传学. 135 (1), 81-95 (1993).
  19. Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
  20. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
  21. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. 遗传学. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  24. Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
  25. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  26. Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
  27. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  28. Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
  29. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. 遗传学. 161 (3), 1197-1208 (2002).

Play Video

Cite This Article
Gevedon, O., Bolus, H., Lye, S. H., Schmitz, K., Fuentes-González, J., Hatchell, K., Bley, L., Pienaar, J., Loewen, C., Chtarbanova, S. In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59720, doi:10.3791/59720 (2019).

View Video