रक्तस्रावी स्ट्रोक के रोग परिणामों का अध्ययन करने के लिए Zebrafish लार्वा का उपयोग
Summary
यहां हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए मस्तिष्क चोट, गतिकीय घाटे और neuroinflammation के बाद zebrafish लार्वा में मस्तिष्क में खून बह रहा है, मानव इंट्रा नकसीर के संदर्भ में (ICH) ।
Abstract
उच्च वैश्विक मृत्यु दर के साथ स्ट्रोक के सबसे गंभीर उपप्रकार होने के बावजूद, इंट्रा नकसीर (ICH) के साथ रोगियों के लिए कोई विशिष्ट उपचार है । मॉडलिंग ICH पूर्व चिकित्सकीय मुश्किल साबित किया है, और वर्तमान कृंतक मॉडल खराब मानव ICH के सहज प्रकृति संक्षेप । अत इस रोग तंत्र के अध्ययन के लिए और संभावित औषध खोज के लिए वैकल्पिक पूर्व नैदानिक पद्धतियों की तत्काल आवश्यकता है ।
Zebrafish का उपयोग ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक तेजी से लोकप्रिय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, मुख्य रूप से लाभ की एक संख्या के कारण वे रोग के स्तनधारी मॉडल पर अधिकारी, विपुल प्रजनन दर और लार्वा पारदर्शिता सहित जीने के लिए अनुमति इमेजिंग. अंय समूहों की स्थापना की है कि zebrafish लार्वे आनुवंशिक या मस्तिष्कवाहिकीय विकास के रासायनिक विघटन के बाद सहज च प्रदर्शन कर सकते हैं । इस पद्धति का उद्देश्य प्री-क्लीनिकल आईसीएच अनुसंधान के संदर्भ में ब्रेन हेमरेज के रोग परिणामों का अध्ययन करने के लिए इस तरह के मॉडलों का उपयोग करना है । जी इमेजिंग और गतिशीलता का उपयोग करके assays हैं, मस्तिष्क क्षति, तंत्रिका सूजन और गतिकारक समारोह के बाद आईसीएच का आकलन किया जा सकता है और मात्रा ।
इस अध्ययन से पता चलता है कि मनुष्यों में ब्रेन हेमरेज के प्रमुख रोग परिणामों को zebrafish लार्वा में संरक्षित किया जाता है जो मॉडल जीव को हाइलाइट करता है, जो कि वीवो प्रणाली में एक मूल्यवान है । इस पद्धति का उद्देश्य प्री-क्लीनिकल स्ट्रोक समुदाय को कृंतकों के लिए एक वैकल्पिक पूरक मॉडल प्रणाली के रूप में जेब्राफिश लार्वा मॉडल को नियोजित करने में सक्षम बनाना है ।
Introduction
Intracerebral नकसीर (आईसीएच) के सबसे गंभीर उप प्रकार के स्ट्रोक के सहज मस्तिष्क पोत टूटना और मस्तिष्क क्षति, शारीरिक विकलांगता और अक्सर1मौत के लिए अग्रणी पैरेंकाइमा में खून बह रहा है के साथ जुड़े । आईसीएच2के साथ उच्च मृत्यु दर और रुग्णता दरों से जुड़े होने के बावजूद अंडरपिनिंग एटियलजी और पोस्ट-हेमरेज पैथोलॉजी की समझ अभी भी कमी है । जैसे, वहां कोई विशेष उपचार के लिए आईसीएच को रोकने या रोगी परिणामों में सुधार कर रहे हैं । रोग जीवविज्ञान की हमारी समझ के अधिकांश पूर्व से आया है,3के नैदानिक कृंतक मॉडल, लेकिन अध्ययन करने के लिए इन मॉडलों में तिथि करने के लिए क्लिनिक4,5के लिए किसी भी सफल चिकित्सकीय अनुवाद करने में विफल रहा है । इस असफलता के भाग में कारण हो सकता है, इन पूर्व नैदानिक मॉडल की कुछ सीमाओं को आसानी से मानव रोग की सहज प्रकृति और इनवेसिव सर्जरी के लिए आवश्यकता के लिए स्तनधारियों6में मॉडल उत्पंन करने के लिए संक्षेप अक्षमता सहित, । इसके अतिरिक्त, कृंतकों के साथ व्यावहारिक समस्याओं मुद्रा को बरकरार ऊतक में आईसीएच के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की तेजी से शुरुआत देख के संबंध है । कृंतक मॉडलों से अनुवाद की कमी को देखते हुए, सहज ICH के वैकल्पिक मॉडल का विकास जरूरी है अगर हम इन व्यावहारिक समस्याओं को दूर करने और मदद उपंयास दवा लक्ष्य की पहचान कर रहे हैं ।
संवहनी विकास के आणविक तंत्र अच्छी तरह से zebrafish सहित कशेरुकी के बीच संरक्षित कर रहे है (danio rerio)7। इस प्रकार, इस आदर्श जीव को अपनाना मस्तिष्कवाहिकीय रोग8के अध्ययन के लिए एक और अधिक उपयोगी यंत्रवादी कार्यनीति बन रहा है । Zebrafish मॉडल की एक संख्या उत्पंन किया गया है जो स्ट्रोक से संबंधित फीनोटाइप9,10,11,12से जुड़े संक्षेप । रोग रोगजनन की जांच करने के लिए zebrafish लार्वा का उपयोग स्तनधारी मॉडल8से अधिक व्यावहारिक और वैज्ञानिक लाभ प्रदान करता है । यह उच्च प्रजनन दर, तेजी से विकास और लार्वा पारदर्शिता कि इनवेसिव कृंतकों के साथ जुड़े बाधाओं के बिना intravital इमेजिंग के लिए अनुमति देता है शामिल हैं। युग्मन zebrafish अनुसंधान समुदाय के भीतर उपलब्ध ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों की विस्तृत श्रृंखला के साथ ये लाभ रोग जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए vivo दृष्टिकोण में एक शक्तिशाली करने के लिए मात्रा, रोग का अध्ययन करने के लिए अभी तक उपयोग नहीं आईसीएच के परिणाम ।
मस्तिष्क में रक्त के लिए चोट प्रतिक्रिया13बिफेसिक है; प्राथमिक अपमान न्यूरोनल मौत और कोशिका परिगलन, जो तब नुकसान की एक माध्यमिक लहर है कि जंमजात प्रतिरक्षा सक्रियण द्वारा प्रेरित है शुरू होता है । मस्तिष्क की चोट का दूसरा चरण, विशेष रूप से neuroप्रदाहक घटक, भविष्य में दवा उपचार के लिए एक यथार्थवादी लक्ष्य माना जाता है13. Zebrafish लार्वा पहले14,15,16,17,18,19में वर्णित किया गया है सहज और मस्तिष्क विशिष्ट हेमोरेज । इस तरह के दो मॉडलों में अटोरवस्टैन (एटीवी) का उपयोग कर रहे है 24 एच पोस्ट निषेचन (hpf) को बाधित hmgcr मार्ग और कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण14, और एक bubblehead (bbh) उत्परिवर्ती जो arhgef7 जीन में एक hypomorphic उत्परिवर्तन व्यक्त, βpix, और बाद में तंग अंतर्वाहिकी जंक्शनों18के लिए actin remodeling रोकता है । इन मॉडलों संचलन की शुरुआत में सहज मस्तिष्क विशिष्ट रक्त वाहिका टूटना प्रदर्शन (~ ३३ hpf) । हाल ही में, हम इन मॉडलों की विशेषता है और पता चलता है कि मस्तिष्क चोट प्रतिक्रिया के प्रमुख पहलुओं मनुष्यों और zebrafish लार्वा20के बीच संरक्षित है । इस अध्ययन को प्राप्त करने के लिए और zebrafish लार्वा में सहज मस्तिष्क हेमोरेज कल्पना और कैसे मस्तिष्क की चोट, और चलन और neuroinflammatory फीनोटाइप कि मानव की स्थिति से संबंधित मात्रा करने के लिए आवश्यक कार्यप्रणाली को दर्शाता है । ये डेटा और तकनीक पूर्व नैदानिक आईसीएच अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान पूरक प्रणाली के रूप में इस मॉडल प्रजातियों के उपयोग का समर्थन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन से पता चलता है कि zebrafish लार्वा में आईसीएच मस्तिष्क चोट प्रतिक्रिया लाती है कि मानव की स्थिति है कि व्यवस्थित रूप से assayed और मात्रा की जा सकती है के प्रमुख पहलुओं recapitulates । Zebrafish सहज, जो भविष्य में दवा हस्तक्षेप अध्ययन रक्त प्रेरित मस्तिष्क चोट को लक्षित करने पर ध्यान केंद्रित के बजाय पोत टूटना रोकने के17,28के साथ सहायता करेगा की एक सुसंगत और reproducible मॉडल प्रदान करते हैं । वास्तव में, रोग शुरुआत नैदानिक स्थिति के समान की तेजी से प्रकृति को देखते हुए, इस तरह के एक दृष्टिकोण भविष्य में सफल अनुवाद के लिए रोमांचक संभावनाएं प्रदान करता है ।
कुछ सीमाएं zebrafish लार्वा के उपयोग के साथ जुड़े रहे हैं, जैसे एक विकासशील प्रणाली और वर्गीकरण रैंक के उपयोग के रूप में, लेकिन इस मॉडल के व्यावहारिक और वैज्ञानिक लाभ आईसीएच में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विचार किया जाना चाहिए । नकसीर शुरू करने के लिए या चोट के बाद समय की विस्तारित अवधि में सेलुलर प्रक्रियाओं की निगरानी करने के लिए कोई सर्जरी की आवश्यकता है । Zebrafish pairings के उच्च उर्वरता आसानी से सुलभ और बड़े नमूना आकार उत्पंन करते हैं, और लार्वा के तेजी से विकास के कारण प्रयोगात्मक समयरेखा रोहताश अध्ययन29,30की तुलना में काफी कम है ।
वर्तमान में इन मॉडलों के लिए तत्काल रोग और जीवित बरकरार जानवरों के मस्तिष्क में सहज आईसीइयूलॉजिकल प्रतिक्रिया elucidating के लिए उपयोग करने के लिए फिट हैं । संभवतः, इस मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है मध्यम उच्च throughput दवा स्क्रीन के लिए ICH चिकित्सा, चाहे preventative या वसूली को बढ़ावा देने । इस प्रकार, इस अध्ययन में प्रस्तुत की पोस्ट-च विकृतियों पूर्व नैदानिक आईसीएच अनुसंधान के लिए एक वैकल्पिक, पूरक मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ डेविड स्पेलर और उपकरण के उपयोग के लिए मैनचेस्टर सिस्टम्स Microscopy कोर सुविधा के विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, प्रो रिचर्ड Baines के उपयोग के लिए DanioVision और डॉ जैक नदियों-सांख्यिकी परामर्श के लिए Auty. Bbh लाइन कृपया डॉ सारा बच्चे की प्रयोगशाला से निकोल Munsie द्वारा कैलगरी विश्वविद्यालय में साझा किया गया । हम प्रो स्टीफन रेनशॉ, डॉ एडम हुल्स्टोन, डॉ एंड्रयू बडरॉक और डॉ हेलेन यंग को फिश लाइंस और इक्विपमेंट के लिए भी धन्यवाद देते हैं ।
इस अध्ययन NC3Rs द्वारा समर्थित किया गया था (नेकां/N002598/1), स्ट्रोक एसोसिएशन (TSA LECT 2017/02), युग नेट ंयूरॉन (श्री/M501803/ हम भी विशेष रूप से नेटली केट मॉस ट्रस्ट और उनके जारी वित्तीय सहायता के लिए जीव विज्ञान, चिकित्सा और स्वास्थ्य के मैनचेस्टर संकाय के विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं ।
Materials
| 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
| 28 °C incubator | LMS | 210 | |
| Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
| Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
| Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
| E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
| EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
| Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
| Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
| Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
| Low melt agarose | Promega | V2111 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
| Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
| Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
| MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
| P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
| P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
| Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
| Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
| Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
| Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
| Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
| Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
| Zen software | Zeiss | version 2.3 |
References
- An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update. Journal of stroke. 19 (1), 3 (2017).
- WHO. . The top 10 causes of death. , (2017).
- Casals, J. B. The use of animal models for stroke research: a review. Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).
- Kellner, C. P., Connolly, E. S. Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation. Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).
- Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).
- ASPA. . 1986 amendments. , (2012).
- Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. . Methods in cell biology. 105, 137-161 (2011).
- Walcott, B. P., Peterson, R. T. Zebrafish models of cerebrovascular disease. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).
- Liu, C. Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction. Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).
- Kasher, P. R. Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome. The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).
- Wen, J. Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish. Brain research. 1644, 70-78 (2016).
- Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos. International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).
- Mracsko, E., Veltkamp, R. Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage. Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388 (2014).
- Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway. Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).
- Shen, M. Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening. Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).
- Huang, B. Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility. Pharmacological research. , (2017).
- Li, S. Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin. Cell death discovery. 3, 17051 (2017).
- Liu, J. A βPix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).
- ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor β-Pix. The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).
- Crilly, S. Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage. F1000Research. 7, (2018).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Traver, D. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238 (2003).
- Morsch, M. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Liang, J. O. . Zebrafish in the Classroom. , (2011).
- Yang, R. Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage. Disease Models & Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).
- Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. Experimental animal models of intracerebral hemorrhage. Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).
- Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).
