DNAzyme-afhankelijke analyse van rRNA 2 '-O-methylatie

1. stammen, media en buffer recepten Bereid gist (S. cerevisiae) media zoals hier beschreven: YP (1% w/v gistextract, 2% w/v bacteriologische peptone), en glucose en galactose aandelen bij 20% w/v. Bereid Natriumacetaat (NaAc)-EDTA (AE) buffer zoals hier beschreven: 50 mM NaAc pH 5,3 en 10 mM EDTA. Bereid de 10-23 DNAzyme 4x incubatie buffer voor zoals hier beschreven: 24 mM tris pH 8,0, 60 mM NaCl en 10-23 DNAzyme 4x reactiebuffer: 200 mM tris pH 8,0 en 600 mM NaCl. Bereid 8-17 DNAzyme 2x reactie buffer zoals hier beschreven: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2en 15 mm MnCl2. Bereid 10x MOPS buffer zoals hier gedetailleerd: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 en 1.5 x monster Denatureringbuffer: 50% v/v formamide, 20% v/v formaldehyde, 1.5 x MOPS buffer. Verkrijgen van S. cerevisiae stammen, BY4741 (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1:: SNR13 (als BY4741 maar GAL1:: SNR13: KANmX); GAL1:: SNR47 (als BY4741 maar GAL1:: SNR47: HIS3mX). Voor deze analyse kan elke andere gist stam worden gebruikt. 2. DNAzyme ontwerp Vind RNA-volgorde van belangstelling of putatieve methylatiesite met behulp van een geschikte database. Voor S. cerevisiae SnoRNA targets, gebruik gist SnoRNA database: http://People.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14 Om de methylatieplaats van belang te vinden, bijvoorbeeld snR13 afhankelijke site, selecteert u “snR13” en noteer de positie van de gemodificeerde nucleotide (bijv. snR13 geleide A2281 in 25S rRNA). Zoek sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de gemodificeerde nucleotide met behulp van de juiste database. Voor S. cerevisiae, gebruik maken van de Saccharomyces Genoome database: https://www.yeastgenome.org/ Zoek naar de doelgennaam bijvoorbeeld RDN25 (codering 25S rRNA). Selecteer op het tabblad “sequentie” 10-15 nucleotiden stroomopwaarts (5 ‘ arm) en stroomafwaarts (3 ‘ arm) van de methylatieplaats bij gebruik van een 10-23 DNAzyme assay en 20 nucleotiden stroomopwaarts (5 ‘ arm) en stroomafwaarts (3 ‘ arm) van de methylatieplaats voor een 8-17 DNAzyme. Maak complementaire sequenties van 5 ‘ en 3 ‘ armen. Flank 10-23 of 8-17 DNAzyme katalytische sequentie met complementaire sequenties van 5 ‘ en 3 ‘ armen. Bestel DNAzyme als een normaal DNA-oligonucleotide van de leverancier. 3. S. cerevisiae groeicondities Opmerking: S. cerevisiae BY4741 strain derivaten werden gebruikt, waarbij de uitdrukking van ofwel SNR13 of SNR47 SnoRNA wordt gedreven door de induceerbare cytochromen GAL1 promotor. Om te induceren of remmen hun synthese, groeien cellen op medium met galactose (GAL1-afhankelijke transcriptie op) of glucose (GAL1-afhankelijke transcriptie uit). Als een controle, gebruik maken van de wild type stam (BY4741) geteeld hetzij op galactose of glucose. Kweek de giststammen in een geschikt medium en voorwaarden. Voor het analyseren van GAL1:: SNR13 en GAL1:: SNR47 stammen evenals de isogene wild type stam, groeien cellen in 50 ml YP media met 2% glucose (ypd) of galactose (ypgal) bij 30 ° c naar de middelste exponentiële fase. Centrifugeer cellen bij 1.000 x g, gedurende 3 minuten bij 4 °c. Gooi de supernatant weg en houd de pellets. Vries celpellets in vloeibare stikstof en bewaar ze bij-80 °C.Let op: Vloeibare stikstof kan ernstige cryogene brandwonden veroorzaken. Draag altijd beschermende kleding en oefen veiligheidsmaatregelen.Opmerking: Celpellets kunnen worden bewaard bij-80 °C tot 1 maand. Het protocol kan hier worden onderbroken indien nodig. 4. RNA-isolatie15 Opmerking: Gebruik de meest geschikte methode om RNA te isoleren. Voor gist S. cerevisiaekan een hot-PHENOL RNA-extractie worden gebruikt. Voeg 1 mL ijskoud water toe, hervat de pellets en breng resuspendeerde cellen over naar 1,5 mL microbuisjes. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 sec. bij 4 °c en verwijder het supernatant. Voeg 400 μL AE-buffer toe en hervat de cellen.Opmerking: De stappen 4.4-4.15 worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Voeg 40 μL 10% SDS en 400 μL zuur fenol toe (pH 4,5).Let op: Fenol is giftig en dient te worden behandeld onder een rook afzuigkap. Draag altijd een Labcoat, beschermende handschoenen en een bril bij het werken met fenol. Gooi de afvalstoffen weg volgens de institutionele voorschriften. Meng goed door grondig voor 20 sec. Incuberen bij 65 °C gedurende 10 min. Elke 2 min, open en sluit de buis om de druk los te maken en draai de buis 2-3 keer om de fasen te mengen. Breng de buizen over naar-80 °C en incuberen gedurende 10 min. Ontdooi de buisjes op de Bank en centrifugeer bij 20.000 x g, gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenste fase over naar een nieuwe buis met 400 μL zuur fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1). De Interphase niet verstoren.Let op: Chloroform is giftig en dient te worden behandeld onder een rook afzuigkap. Draag altijd een Labcoat, beschermende handschoenen en een bril bij het werken met chloroform. Gooi het afval weg volgens de institutionele voorschriften. Meng goed door grondig gedurende 30 sec. en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenste fase (~ 400 μL) over in een nieuwe buis met 400 μL chloroform. Meng goed door grondig gedurende 30 sec. en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenste fase (~ 300-350 μL) over in een nieuwe buis met 1 mL EtOH en 40 μL van 7,5 M ammoniumacetaat (NH4AC). Meng door de buis een paar keer te spiegelen. Inincuberen bij-80 °C gedurende 2 uur of ‘s nachts bij-20 °C.Opmerking: De procedure kan hier worden onderbroken. Centrifugeer bij 20.000 x g, gedurende 10 min bij 4 °c. Een kleine, witte RNA-pellet zal zichtbaar worden op de bodem van de buis. Verwijder EtOH door Pipetteer om te voorkomen dat de pellet wordt gestoord. Voeg 1 mL 70% EtOH toe en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder 70% EtOH door Pipetting. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 15 sec. en verwijder de overgebleven EtOH met een pipet van 2-20 μL. Laat de buis gedurende 5 minuten open op de Bank om de RNA-pellet te drogen.Opmerking: RNA pellet verandert de kleur van wit naar transparant wanneer het droog is. Hervat de RNA-pellet in 30 μL RNase/DNase-vrije H2O, breng de buis onmiddellijk over op het ijs en meet de RNA-concentratie op de microspectrophotometer. Vries de monsters bij-20 °C.Opmerking: RNA kan worden bewaard bij-20 °C tot 1 maand en bij-80 °C tot 1 jaar. De procedure kan hier worden onderbroken of direct naar de volgende stap worden door gegaan. 5. DNAzyme spijsvertering 10-23 DNAzyme spijsvertering In 1,5 mL buisjes bereiden een incubatie mengsel door 5 μg RNA, 200 pmol van 10-23 DNAzyme (2 μL 100 mM stamoplossing) en 2,5 μL 4x 10-23 incubatie buffer in een totaal volume van 10 μL te combineren. Houd de buizen op ijs. Breng de buisjes over naar een droog warmte blok op 95 °C en incuberen gedurende 3 min. Breng de buisjes direct over op het ijs en inbroed gedurende 5 minuten. Draai kort en zet de buisjes weer op het ijs. Voeg 20 U RNase-remmer toe (bijv. 0,5 μL RiboLock RNase-remmer). Plaats de buisjes in een droge warmte blok set voor 25 °C en inbroed gedurende 10 minuten. Bereid ondertussen een reactiemengsel in een buis van 1,5 μL door 5 μL 4x 10-23 reactie buffer te combineren met 4 μL van 300 mM MgCl2 en 1 μl H2O. plaats de buis in een droog blok ingesteld op 37 °c. Breng de incubatie-mix over naar een droge warmteblokkeer set voor 37 °C en voeg 10 μL pre-warmed-reactiemix toe. Incuberen de reactie bij 37 °C gedurende 1 uur. Breng de buisjes op het ijs over en ga verder naar stap 5.3.1. 8-17 DNAzyme spijsvertering Bereid een micro buisje van 1,5 mL met 5 μg RNA in een totaal volume van 6 μL. Houd de tube op ijs. Bereid een micro buisje van 1,5 mL met 400 pmol van 8-17 DNAzyme (4 μL uit 100 mM voorraad). Houd de tube op ijs. Breng de buisjes over naar een droge warmte blokset voor 95 °C en inbroed gedurende 2 minuten. Verplaats het RNA-monster op ijs. Draai de buis met DNAzyme gedurende 5 sec. en inbroed bij 25 °C gedurende 10 minuten. Bereid tegelijkertijd een buis van 1,5 mL met 10 μL van 2x 8-17 reactie buffer en inbroed bij 25 °C. Bereid een reactiemengsel door 10 μL voorverwarmde 2x-reactie buffer toe te voegen aan de buis met DNAzyme. Breng 14 μL van de reactiemix over in de buis met RNA en Voeg 20 U RNase-remmer toe. Inincuberen de reactie bij 25 °C gedurende 2 uur. Breng de buis over op ijs en ga verder naar RNA-zuivering (stap 5.3.1). RNA-zuivering Voeg 350 μl water en 400 μL chloroform toe aan de reactie buis, meng goed door grondig gedurende 30 sec. en centrifuge bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenste fase (~ 300-350 μL) over in een nieuwe buis met 1 mL EtOH, 40 μL 7,5 M NH4AC en 1 μL glycogeen (10 μg/μL). Meng door de buis een paar keer te spiegelen. Inincuberen bij-80 °C gedurende 2 uur of ‘s nachts bij-20 °C.Opmerking: De procedure kan hier worden onderbroken. Herhaal de stappen van 4,15 tot 4,21. Rebreng de RNA-pellet in 10 μL RNase/DNase-vrij H2O en zet de buisjes direct op het ijs. Vries de monsters bij-20 °C.Opmerking: RNA kan worden bewaard bij-20 °C tot een maand en bij-80 °C tot 1 jaar. De procedure kan hier worden onderbroken of doorgaan naar RNA elektroforese. 6. RNA elektroforese Spray de elektroforese apparatuur (tank, tray, kam) met 1% SDS, laat 15 minuten staan en spoel met veel ddH2O. Los 1,5 g agarose op in 127,5 mL ddH2O door het in de magnetron te verwarmen. Voeg 15 mL 10x MOPS en 7,5 mL 37% formaldehyde toe aan de agarose-oplossing (totaal volume is 150 mL).Let op: Formaldehyde is giftig en dient te worden behandeld onder een rook afzuigkap. Draag altijd een Labcoat, beschermende handschoenen en een bril bij het werken met formaldehyde. Gooi het afval weg volgens de institutionele voorschriften. Voeg een gepaste hoeveelheid gelvlek naar keuze toe aan de agarose oplossing (bijv. 15 μL SYBR Safe DNA gel Stain). Meng goed en giet de agarose in de tray. Plaats een kam onmiddellijk in de gel. Laat het voor 45 min onder de dampkap. Bedek het bakje met aluminiumfolie bij gebruik van een lichtgevoelige gelvlek. Bereid 600 mL van 1x MOPS-buffer. RNA monstervoorbereiding Combineer in een buis van 1,5 mL 10 μL van het verteerde en gezuiverde RNA-monster, 5 μL monster Denatureringbuffer en 0,5 μL 6x-laad kleurstof.Let op: Formamide is giftig en dient te worden behandeld onder een rook afzuigkap. Draag altijd een Labcoat, beschermende handschoenen en een bril bij het werken met formamide. Gooi het afval weg volgens de institutionele voorschriften. Incuberen RNA monsters bij 70 °C gedurende 5 min. Breng de monsters over op ijs. Inincuberen gedurende 5 min. Draai kort voor het laden op de gel. Zet de gel in de elektroforese tank en vul met 1x MOPS buffer. Laad het volledige volume van elk monster (15 μL) op de gel. Lopen op 80 V tot broomfenolblauw 2/3 van de gellengte bereikt. Afbeelding van de gel met behulp van een Imager geschikt voor het detecteren van de gekozen gelvlek (bijv., UV-transilluminator).