Un saggio di assenza di stasse reattiva (DARTS) di affinità dei farmaci semi-quantitativa per studiare l'interazione tra Rapamicina e mTOR
Summary
In questo studio, abbiamo migliorato le capacità di analisi dei dati dell’esperimento DARTS monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine e stimando l’affinità delle interazioni proteina-ligando. Le interazioni possono essere tracciate in due curve: una curva proteolitica e una curva di dipendenza da dose. Abbiamo usato l’interazione mTOR-rapamycin come caso esemplare.
Abstract
Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) è un metodo robusto per rilevare nuovi bersagli proteici di piccole molecole. Può essere utilizzato per verificare le interazioni noto piccole molecole-proteine e per trovare potenziali bersagli proteici per i prodotti naturali. Rispetto ad altri metodi, i DARS utilizzano molecole native, non modificate, piccole ed è semplice e facile da usare. In questo studio, abbiamo ulteriormente migliorato le capacità di analisi dei dati dell’esperimento DARTS monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine e stimando l’affinità delle interazioni proteina-ligando. Le interazioni proteina-ligando possono essere tracciate in due curve: una curva proteolitica e una curva dose-dipendenza. Abbiamo usato l’interazione mTOR-rapamycin come caso esemplare per l’istituzione del nostro protocollo. Dalla curva proteolitica abbiamo visto che la proteolisi di mTOR da pronase è stata inibita dalla presenza di raamicina. La curva dose-dipendenza ci ha permesso di stimare l’affinità vincolante di rapamicina e mTOR. Questo metodo è probabilmente un metodo potente e semplice per identificare con precisione nuove proteine bersaglio e per l’ottimizzazione del coinvolgimento del bersaglio farmacologico.
Introduction
Identificare le proteine bersaglio di piccole molecole è essenziale per la comprensione meccanicistica e lo sviluppo di potenziali farmaci terapeutici1,2,3. La cromatografia di affinità, come metodo classico per identificare le proteine bersaglio di piccole molecole, ha prodotto buoni risultati4,5. Tuttavia, questo metodo ha delle limitazioni, in quanto la modifica chimica di piccole molecole spesso si traduce in una specificità o affinità di legame ridotta o alterata. Per superare questi limiti, sono state recentemente sviluppate e applicate diverse nuove strategie per identificare i piccoli bersagli molecolari senza modificachimica delle piccole molecole. Questi metodi diretti per l’identificazione di piccoli obiettivi di piccole molecole prive di etichette includono la stabilità del bersaglio reattiva di affinità farmacologica (DARTS)6, stabilità delle proteine dai tassi di ossidazione (SPROX)7, il saggio cellulare di spostamento termico (CETSA)8 ,9, e tpp proteoma termico (TPP)10. Questi metodi sono altamente vantaggiosi perché usano piccole molecole naturali e non modificate e si basano solo su interazioni di legame diretto per trovare le proteine bersaglio11.
Tra questi nuovi metodi, DARTS è una metodologia relativamente semplice che può essere facilmente adottata dalla maggior parte dei laboratori12,13. I DARS dipendono dal concetto che le proteine legate al ligando dimostrano una suscettibilità modificata alla degradazione enzimatica rispetto alle proteine non legate. La nuova proteina bersaglio può essere rilevata esaminando la banda alterata nel gel SDS-PAGE attraverso la spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC-MS/MS). Questo approccio è stato implementato con successo per l’identificazione di obiettivi precedentemente sconosciuti di prodotti naturali e farmaci14,15,16,17,18, 19. È anche potente come mezzo per vagliare o convalidare il legame di composti a una proteina specifica20,21. In questo studio, presentiamo un miglioramento all’esperimento monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine con piccole molecole e identificando le affinità di legame proteina-ligando. Usiamo l’interazione mTOR- rapamicia come esempio per dimostrare il nostro approccio.
Protocol
Representative Results
Discussion
I DARS consentono di identificazione di piccoli bersagli molecolari sfruttando l’effetto protettivo del legame proteico contro la degradazione. I DARS non richiedono alcuna modifica chimica o immobilizzazione della piccola molecola26. Questo permette di utilizzare piccole molecole per determinare i loro bersagli proteici di legame diretto. I criteri di valutazione standard per il metodo classico DARTS includono colorazione gel, spettrometria di massa e gonfiore occidentale12</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni di ricerca NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 e da una sovvenzione di ricerca DOD W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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