Estudando a dinâmica organelle em células B durante a formação de sinapse imune

Os linfócitos B são uma parte essencial do sistema imunológico adaptativo responsável pela produção de anticorpos contra diferentes ameaças e patógenos invasores. A eficiência da produção de anticorpos é determinada pela capacidade das células B de adquirir, processar e apresentar antígenos encontrados em uma forma solúvel ou superfície-tethered^1,2. O reconhecimento dos antígenos anexados à superfície de uma célula de apresentação, pelo BCR, conduz à formação de um contato intercelular próximo denominado é^3,4. Dentro desta plataforma dinâmica a sinalização a jusante BCR-dependente e a internalização dos antígenos em compartimentos Endo-lysosome acontecem. Os antígenos de uptomado são processados e montados em moléculas de MHC-II e apresentados subseqüentemente aos linfócitos de T. As interações produtivas do B-T, denominadas cooperação da pilha de B-T, permitem que os linfócitos de B recebam os sinais apropriados, que promovem sua diferenciação em pilhas de plasma de produção de anticorpos ou em pilhas de memória⁸.

Dois mecanismos foram envolvidos na extração do antígeno por pilhas de B. A primeira conta com a secreção de proteases originadas de lisossomos que passam por recrutamento e fusão na fenda sináptica^5,6. O segundo, depende das forças de tração miosina IIA-mediadas que desencadeia a invaginação do antígeno contendo membranas que são internalizadas em Poços revestidos com clathrin⁷. A modalidade da extração do antígeno confia nas propriedades físicas da membrana em que os antígenos são encontrados. Não obstante, em ambos os casos, as pilhas de B submetem-se a dois eventos de remodelação principais: reorganização do citoesqueleto do actina e polarização das organelas ao is. A remodelação do citoesqueleto de Actin envolve um estágio de espalhamento inicial, onde as saliências Actin-dependentes na membrana sináptica aumentam a superfície no contato com o antígeno. Isto é seguido por uma fase de contração, onde os BCRS acoplados com antígenos são concentrados no centro do é pela ação concertada de motores moleculars e do citoesqueleto do actina que remodelam^{8,9,10, 11}. polarization das organelas igualmente confia na remodelação do cytoskeleton do actina. Por exemplo, o centrosome torna-se desacoplado do núcleo, por despolimerização local de actina associada, o que permite o reposicionamento desta organela ao is^5,12. Nas células B, o reposicionamento do centrosome para um pólo celular (IS) orienta o recrutamento lisossome para a membrana sináptica, que após a secreção pode facilitar a extração e/ou processamento de antígenos de superfície-tethered⁶. Os lisossomas recrutados no IS são enriquecidos com MHC-II, o que favorece a formação de complexos peptídeos-MHC-II em compartimentos endossômicos a serem apresentados às células T¹³. Adicionalmente, o aparelho de Golgi também tem sido observado para ser estreitamente recrutado para o IS¹⁴, sugerindo que as vesículas derivadas de Golgi da via secretora poderiam estar envolvidas na extração e/ou processamento de antígenos.

Completamente, os rearranjos intracelular do organela e do citoesqueleto em pilhas de B durante a formação do sinapse são as etapas chaves que permitem a aquisição e o processamento eficientes do antígeno exigidos para sua ativação mais adicional. Neste trabalho apresentamos protocolos detalhados sobre como realizar exames de imagem e bioquímica em células B para estudar a remodelação intracelular de organelas associadas à formação de um IS. Essas técnicas incluem: (i) imunofluorescência e análise de imagens de células B ativadas com grânulos revestidos por antígeno e em coberturas revestidas com antígeno, o que permite a visualização e quantificação de componentes intracelulares que são mobilizados para o IS e (II ) isolamento de frações enriquecidas centrosome em células B por ultracentiogação em gradientes de sacarose, o que permite a identificação de proteínas associadas ao centrosome, potencialmente envolvidas na regulação da polaridade celular.