골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화
Summary
우리는 골격 근 생검 조직에서 얻은 인간 1 차적인 근육 전구 세포 (hMPCs)를 분리, 배양, 특성화 및 분화하는 기술을 제시합니다. 이러한 방법을 통해 획득되고 특징지어지는 hMPC는 인간 근생 및 골격 근 재생과 관련된 연구 질문을 이후에 해결하는 데 사용될 수 있다.
Abstract
1 차적인 인간 조직 및 세포의 사용은 골격 근 재생 과정과 같은 생물학적 및 생리적 과정의 조사에 이상적입니다. 수집된 조직으로부터의 낮은 세포 수율및 많은 정도의 공여자 이질성을 포함하여 골격근 생검에서 유래한 인간 1차 성인 줄기 세포, 특히 인간 근육 전구 세포(hMPC)와 함께 일하는 데 있어 인식된 과제가 있습니다. 문화 간의 성장과 죽음의 매개 변수. 이질성을 실험 설계에 통합하려면 더 큰 샘플 크기가 필요하지만, hMPC 확장 용량의 가변성을 뒷받침하는 메커니즘을 식별할 수 있으므로 더 잘 이해할 수 있습니다. 골격 근육 재생의 이질성. 배양물의 확장 능력을 구별하는 새로운 메커니즘은 골격 근 재생을 개선하기 위한 치료법의 개발로 이어질 가능성이 있다.
Introduction
골격 근은 인체에서 가장 큰 장기 시스템으로 전신 질량의 30-40 %를 차지합니다1. 운동에서 잘 알려진 역할 외에도 골격 근은 체온과 자세를 유지하고 전신 영양소 항상성에 중심적인 역할을합니다. 인간 참가자, 동물 및 세포 배양 모델과 관련된 연구는 모두 골격 근 생물학 및 재생과 관련된 질문을 해결하는 데 가치가 있습니다. 인간 1차 근육 전구 세포(hMPC)의 분리 및 배양은 인간 샘플에 세포 배양 기술 및 조작을 허용하는 견고한 모델을 제공한다. hMPC를 사용하는 장점은 각 기증자2,3으로부터유전및 대사 표현형을 유지한다는 것입니다. 기증자 표현형의 유지 보수는 연구원이 myogenic 프로세스에 있는 개별적인 변이를 검토하는 것을 허용합니다. 예를 들어, 우리는 hMPC 인구 확장 용량 4의 연령 및 성별 관련 차이를식별하기 위해 hMPC 특성화 방법을 사용했습니다.
이 프로토콜의 목적은 골격 근 생검 조직으로부터 hMPC를 분리, 배양, 특성화 및 구별하는 기술을 자세히 설명하는 것입니다. hMPC를 설명하고 hMPC 격리5,6에대한 잠재적 인 세포 표면 제조 자를 식별 한 이전 작업을 기반으로이 프로토콜은 hMpc의 특성화에 격리를 연결하여 지식의 중요한 격차를 채웁니다. 또한, 이 프로토콜에 포함된 상세한 단계별 지침은 hMPC에 대한 사전 경험이 제한된 사람들을 포함하여 광범위한 과학 청중에게 hMPC 격리 및 특성화에 접근할 수 있도록 합니다. 우리의 프로토콜은 세포 집단을 추적하기 위하여 화상 진찰 세포계의 사용을 기술하는 첫번째 중 입니다. 새로 설계된 이미징 세포계는 최첨단, 높은 처리량 및 마이크로플레이트 기반으로, 몇 분 내에 배양 용기의 각 우물에서 모든 세포의 라이브 세포 이미징, 세포 카운팅 및 다채널 형광 분석을 가능하게 합니다. 이 시스템은 배양에 최소한의 중단으로 전체 세포 집단의 증식 및 생존력의 동적 변화를 신속하게 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 상이한 공여자로부터 유래된 각 배양물의 성장 역학을 결정하기 위해 시험관 내에서 연속적인 날에 합류의 객관적인 척도를 수행할 수 있다. 문헌의 많은 프로토콜, 특히 MPC의 분화를 수반하는 프로토콜은, 분화 또는 치료를 개시하기 전에 세포가정의된 수준의 합류에 도달하도록 요구한다 7. 우리의 방법은 연구원이 편견, 비 주관적인 방식으로 처리를 시작하는 것을 허용하는 문화 용기에 있는 각 우물의 합류의 객관적인 결정을 허용합니다.
과거에는 1차 hMPC를 사용하는 주요 제한은 실험에 사용할 수 있는 셀 수를 제한하는 낮은 수율이었습니다. 우리와 다른 사람들은 골격 근 생검 조직에서 MPC의 수율을 보여 주었다 조직의 밀리그램 당1-15 MPC (그림 1)8. 우리의 프로토콜은 형광 활성화 세포 선별 (FACS)으로 정제하기 전에 세포의 네 개의 통로를 허용하기 때문에, 소량의 생검 조직 (50-100 mg)에서 파생 된 극저온 보존 된 hMPC 수율은 연구 목표를 해결하기에 충분합니다. 여러 실험이 필요합니다. 우리의 FACS 프로토콜은 ~ 80 % 순수 (Pax7 양성) MPC 인구를 생성하므로 우리의 프로토콜은 수율과 순도 모두에 최적화되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
1 차적인 hMPCs는 골격 근육 생물학 및 재생 과정을 이해하는 데 사용되는 중요한 연구 모델입니다. 추가적으로, hMPC는 치료에 이용될 가능성이 있습니다. 그러나, 인간10으로부터 유래된 세포의 제한된 이해를 포함하여 연구 및 치료 모두에 대한1차 hMPC 사용에 대한 인식된 과제가 있다. 또한 hMPC의 사용 가능성을 제한하고 연구 결과11에영향을 미칠 수 있는 기증?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 형광 활성화 세포 분류에 그들의 도움을 위한 코넬 대학, 생명 공학 자원 센터 화상 진찰 시설에 감사드립니다. 우리는 또한 참가자 모집과 골격 근육 생검을 실시에 대한 에리카 벤더와 그녀의 도움 몰리 겔러에게 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 그들의 시간과 연구에 참여에 대한 참가자들에게 감사드립니다. 이 작품은 수상 번호 R01AG058630 (B.D.C. 및 A.E.T.에 따라 국립 보건원의 노화에 대한 국립 연구소에 의해 지원되었다), 의학 연구를위한 글렌 재단과 주니어 교수에 대한 노화 연구 보조금을위한 미국 연맹에 의해 (B에 . DC), 그리고 코넬 여성대통령위원회(A.E.T.)에 의해.
Materials
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
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