Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Skelettmuskel ist das größte Organsystem im menschlichen Körper, macht 30 bis 40% der ganzen Körpermasse¹. Neben seiner anerkannten Rolle in der Fortbewegung, Skelettmuskel hält Körpertemperatur und Körperhaltung, und spielt eine zentrale Rolle in ganzkörperlichen Nährstoff Homöostase. Die Forschung unter Beteiligung menschlicher Teilnehmer, Tiere und Zellkulturmodelle ist wertvoll, um Fragen der Skelettmuskelbiologie und Regeneration zu beantworten. Isolation und Kultur der menschlichen Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs) bietet ein robustes Modell, das es ermöglicht, Zellkulturtechniken und Manipulationen auf menschliche Proben anzuwenden. Ein Vorteil der Verwendung von hMPCs ist, dass sie den genetischen und metabolischen Phänotyp von jedem Spender behalten^2,3. Die Aufrechterhaltung des Spenderphänotyps ermöglicht es forschern, interindividuelle Variationen im myogenen Prozess zu untersuchen. Zum Beispiel haben wir unsere hMPC-Charakterisierungsmethode eingesetzt, um alters- und geschlechtsbedingte Unterschiede in der hMPC-Populationsexpansionskapazität⁴zu identifizieren.

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Techniken zur Isolierung, Kultur, Charakterisierung und Unterscheidung von hMPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe zu beschreiben. Aufbauend auf früheren Arbeiten, die hMPCs beschrieben und potenzielle Zelloberflächenhersteller für die hMPC-Isolierung^5,6identifiziert haben, schließt dieses Protokoll eine kritische Wissenslücke, indem es die Isolation mit der Charakterisierung von hMPCs verknüpft. Darüber hinaus machen die detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitungen in diesem Protokoll die hMPC-Isolierung und -Charakterisierung einem breiten wissenschaftlichen Publikum zugänglich, einschließlich derjenigen mit begrenzter Vorerfahrung mit hMPCs. Unser Protokoll gehört zu den ersten, die die Verwendung eines bildgebenden Zytometers zur Verfolgung von Zellpopulationen beschreiben. Neu entwickelte bildgebende Zytometer sind modernste, hochdurchsatz- und mikroplattenbasierte, die live zellbildende, Zellzählung und Mehrkanalfluoreszenzanalyse aller Zellen in jedem Brunnen eines Kulturgefäßes innerhalb von Minuten ermöglichen. Dieses System ermöglicht eine schnelle Quantifizierung dynamischer Veränderungen der Proliferation und Lebensfähigkeit einer gesamten Zellpopulation mit nur minimalen Unterbrechungen der Kultur. Beispielsweise sind wir in der Lage, objektive Maßnahmen des Zusammenflusses an aufeinanderfolgenden Tagen in vitro durchzuführen, um die Wachstumskinetik jeder Kultur zu bestimmen, die von verschiedenen Spendern abgeleitet wurde. Viele Protokolle in der Literatur, insbesondere solche, die die Differenzierung von MFC beinhalten, erfordern, dass Zellen ein definiertes Maß an Zusammenfluss erreichen, bevor sie Differenzierung oder Behandlung einführen⁷. Unsere Methode ermöglicht eine objektive Bestimmung des Zusammenflusses jedes Brunnens in einem Kulturgefäß, so dass Forscher eine unvoreingenommene, nicht-subjektive Behandlung initiieren können.

In der Vergangenheit war eine wesentliche Einschränkung der Verwendung von primären hMPCs niedrige Erträge, die die Anzahl der Zellen begrenzen, die für Experimente verfügbar sind. Wir und andere haben gezeigt, dass die Ausbeute von MPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe 1-15 MPCs pro Milligramm Gewebe beträgt (Abbildung 1)⁸. Da unser Protokoll vier Passagen der Zellen vor der Reinigung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zulässt, reichen unsere kryokonservierten hMPC-Erträge, die aus kleinen Mengen Biopsiegewebe (50 bis 100 mg) gewonnen werden, aus, um Forschungsziele zu erreichen, mehrere Experimente sind erforderlich. Unser FACS-Protokoll erzeugt eine reine (Pax7-positive) MPC-Population von 80 %, daher ist unser Protokoll sowohl für die Ausbeute als auch für die Reinheit optimiert.