العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية
Summary
نقدم تقنيات لعزل خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) التي تم الحصول عليها من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية، وزراعة وتميزها، وتميزها. ويمكن استخدام hMPCs التي تم الحصول عليها وتتميز من خلال هذه الأساليب لمعالجة الأسئلة البحثية المتعلقة بعضلة عضلية الإنسان وتجديد العضلات الهيكلية.
Abstract
استخدام الأنسجة البشرية الأولية والخلايا مثالية للتحقيق في العمليات البيولوجية والفسيولوجية مثل عملية تجديد العضلات الهيكلية. هناك تحديات معترف بها للعمل مع الخلايا الجذعية البشرية الأولية الكبار، وخاصة خلايا ذرية العضلات البشرية (hMPCs) المستمدة من الخزعات العضلات الهيكلية، بما في ذلك انخفاض غلة الخلايا من الأنسجة التي تم جمعها ودرجة كبيرة من عدم تجانس المانحين من النمو وبارامترات الموت بين الثقافات. في حين أن دمج التباين في التصميم التجريبي يتطلب حجم عينة أكبر للكشف عن آثار كبيرة، فإنه يسمح لنا أيضا لتحديد الآليات التي تكمن وراء التباين في قدرة التوسع hMPC، وبالتالي يسمح لنا لفهم أفضل عدم التجانس في تجديد العضلات الهيكلية. الآليات الجديدة التي تميز القدرة على التوسع من الثقافات لديها القدرة على أن تؤدي إلى تطوير العلاجات لتحسين تجديد العضلات الهيكلية.
Introduction
العضلات الهيكلية هي أكبر جهاز في جسم الإنسان، تمثل 30-40٪ من كتلة الجسم كله1. بالإضافة إلى دورها المعترف بها جيدا في الحركة، العضلات الهيكلية تحافظ على درجة حرارة الجسم والموقف، ويلعب دورا مركزيا في التوازن المغذية لكامل الجسم كله. البحوث التي تشمل المشاركين من البشر، والحيوانات، ونماذج ثقافة الخلايا كلها قيمة لمعالجة المسائل المتعلقة بيولوجيا العضلات الهيكلية وتجديد. العزلة والثقافة من خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) يوفر نموذجا قويا يسمح لتقنيات زراعة الخلايا والتلاعب ليتم تطبيقها على العينات البشرية. ميزة استخدام hMPCs هو أنها تحتفظ النمط الظاهري الوراثي والأيضي من كل مانح2،3. صيانة النمط الظاهري المانح يسمح للباحثين لدراسة التباين بين الأفراد في عملية myogenic. على سبيل المثال، لقد استخدمنا طريقة توصيف HMPC لتحديد الاختلافات المتعلقةبالعمر والجنس في قدرة التوسع السكاني HMPC 4.
الغرض من هذا البروتوكول هو تفصيل تقنيات لعزل وثقافة وتوصيف وتمييز hMPCs من أنسجة خزعة العضلات والهيكل العظمي. واستناداً إلى الأعمال السابقة التي وصفت مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية وصانعات سطح الخلية المحتملة لعزل HMPC5و6، فإن هذا البروتوكول يسد فجوة حرجة في المعرفة من خلال ربط العزلة بتوصيف مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. وعلاوة على ذلك، فإن التعليمات التفصيلية التدريجية الواردة في هذا البروتوكول تجعل عزل وتوصيف اللجنة في متناول جمهور علمي واسع، بما في ذلك أولئك الذين لديهم خبرة سابقة محدودة مع مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. بروتوكولنا هو من بين أول من وصف استخدام مقياس الخلايا التصويرية لتعقب مجموعات الخلايا. أجهزة قياس الخلايا التصويرية المصممة حديثًا هي أحدث التقنيات، وعالية الإنتاجية، وقائمة على الصفائح الدقيقة، مما يتيح تصوير الخلايا الحية، وفرز الخلايا، وتحليل الفلورة متعدد القنوات لجميع الخلايا في كل بئر من الأوعية الثقافية في غضون دقائق. ويسمح هذا النظام بالتحديد الكمي السريع للتغيرات الدينامية في انتشار وبقاء مجموعة كاملة من الخلايا مع الحد الأدنى من التعطيل للثقافة. على سبيل المثال، نحن قادرون على تنفيذ مقاييس موضوعية للالتقاء في الأيام المتعاقبة في المختبر لتحديد حركية النمو لكل ثقافة مشتقة من مختلف المانحين. العديد من البروتوكولات في المؤلفات، ولا سيما تلك التي تنطوي على التمييز بين الـ MPCs، تتطلب الخلايا للوصول إلى مستوى محدد من التقاء قبل الشروع في التمايز أو العلاج7. تسمح طريقتنا بتحديد موضوعي للتقاء كل بئر في وعاء ثقافي يسمح للباحثين ببدء العلاج بطريقة غير متحيزة وغير ذاتية.
في الماضي، كان أحد القيود الرئيسية لاستخدام hMPCs الأولية انخفاض الغلة التي تحد من عدد الخلايا المتاحة للتجارب. لقد أظهرنا نحن وآخرون غلة الـ MPCs من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية 1-15 MPCs لكل مليغرام من الأنسجة (الشكل 1)8. لأن بروتوكولنا يسمح لأربعة ممرات من الخلايا قبل تنقية مع فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، لدينا عوائد hMPC المحفوظة بالتبريد، المستمدة من كميات صغيرة من أنسجة خزعة (50-100 ملغ)، كافية لمعالجة أهداف البحوث حيث هناك حاجة إلى تجارب متعددة. لدينا بروتوكول FACS تنتج ~ 80٪ نقية (Pax7 إيجابية) MPC السكان، وبالتالي يتم تحسين بروتوكولنا لكل من العائد والنقاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
HMPCs الأولية هي نموذج بحثي مهم يستخدم لفهم بيولوجيا العضلات الهيكلية وعملية التجديد. بالإضافة إلى ذلك، hMPCs لديها القدرة على استخدامها للعلاج. ومع ذلك، هناك تحديات معترف بها في استخدام hMPCs الأولية لكل من البحث والعلاج، بما في ذلك الفهم المحدود للخلايا المشتقة من البشر10. وهناك أي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون جامعة كورنيل، مرفق التصوير مركز موارد التكنولوجيا الحيوية لمساعدتهم في فرز الخلايا المنشطة الفلورية. كما نشكر مولي هيلر على مساعدتها في توظيف المشاركين وإريكا بندر لإجراء الخزعات العضلية الهيكلية. وأخيرا، نشكر المشاركين على وقتهم ومشاركتهم في الدراسة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للشيخوخة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب رقم الجائزة R01AG058630 (إلى B.D.C. وA.E.T.)، من قبل مؤسسة غلين للبحوث الطبية ومنحة أبحاث الاتحاد الأمريكي للشيخوخة لأعضاء هيئة التدريس المبتدئين (إلى B) . العاصمة)، ومجلس الرئيس للمرأة كورنيل (إلى A.E.T.).
Materials
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D’Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
- Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
- Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
- Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
- Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , (2012).
- Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy – from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
- Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).
