Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten
Summary
SUMO is een essentiële en zeer behouden, kleine ubiquitin-achtige modifier proteïne. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een stress-tolerante recombinant SUMO-trappen eiwit (kmUTAG) te visualiseren native, untagged SUMO geconjugeerde en hun lokalisatie in een verscheidenheid van soorten cellen.
Abstract
Hier presenteren we een nieuwe methode om de sumoylation van eiwitten en hun sub-cellulaire lokalisatie in zoogdiercellen en nematoden oöcyten te bestuderen. Deze methode maakt gebruik van een recombinant gemodificeerde SUMO-trappen eiwit fragment, kmUTAG, afgeleid van de Ulp1 SUMO protease van de stress-tolerante ontluikende gist Kluyveromyces marxianus. Wij hebben de eigenschappen van de kmUTAG voor het bestuderen van sumoylation in een verscheidenheid van modelsystemen zonder het gebruik van antilichamen aangepast. Voor de studie van SUMO, heeft KmUTAG verscheidene voordelen wanneer vergeleken bij antilichaam-gebaseerde benaderingen. Deze stress-tolerante SUMO-trapping reagens is recombinant geproduceerd, erkent native SUMO isovormen van vele soorten, en in tegenstelling tot commercieel beschikbare antilichamen het toont verminderde affiniteit voor vrije, ongeconjugeerde SUMO. Representatieve resultaten hier zijn de lokalisatie van SUMO geconjugeerde in zoogdier weefselkweek cellen en nematoden oöcyten.
Introduction
Het doel van deze methode is het vergemakkelijken van de studie en analyse van SUMO-geconjugeerde eiwitten met behulp van de recombinante SUMO-trapping UTAG (ULP domein tag) eiwit. Zoals hieronder beschreven, UTAG kan worden gebruikt in plaats van andere reagentia en benaderingen te zuiveren, op te sporen en te visualiseren SUMO-gemodificeerde eiwitten. Afhankelijk van de groeiomstandigheden, cellen kunnen bevatten honderden of duizenden eiwitten die zijn gewijzigd met SUMO of SUMO ketens (voor de herziening Zie Kerscher et al. 20061 en Kerscher 20162). Dit is een aanzienlijke moeilijkheid voor de functionele analyses van specifieke SUMO-gemodificeerde eiwitten, vooral omdat slechts een fractie van een bepaalde sumoylation doelstelling is eigenlijk gewijzigd3. Naast hun rol in essentiële cellulaire processen zoals transcriptie regelgeving, eiwit homeostase, de reactie op cellulaire spanning, en Chromatin het remodelleren tijdens mitose en meiose; het is nu voldoende duidelijk geworden dat Sumo, Sumo-gemodificeerde eiwitten, en Sumo pathway componenten hebben ook potentieel als biomarkers voor pathologieën zoals kanker en neurodegeneratieve aandoeningen4,5,6 ,7. Dit onderstreept de noodzaak van robuuste, betrouwbare en gemakkelijk beschikbare instrumenten en innovatieve benaderingen voor de opsporing en functionele analyse van SUMO-gemodificeerde eiwitten in een verscheidenheid van cellen en monsters.
In veel systemen, Sumo-specifieke antilichamen zijn de reagentia van de keuze voor de detectie, isolatie en functionele analyses van Sumo-gemodificeerde eiwitten8,9. Echter, sommige commercieel verkrijgbare SUMO-specifieke antilichamen zijn duur, beperkt in hoeveelheid of beschikbaarheid, vatbaar voor vertonen wild variabele affiniteiten en cross-reactiviteit, en in sommige gevallen gebrek aan reproduceerbaarheid10. Een alternatieve benadering is de uitdrukking van epitope-Tagged SUMO in getransformeerde cellen en organismen, maar het koppelen van epitope Tags aan SUMO kan kunstmatig lager zijn vervoeging aan eiwitten doelstellingen11. Bovendien, Epitopes zijn niet nuttig wanneer niet-getransformeerde cellen of weefsels worden geëvalueerd.
Ulp1 is een behouden SUMO protease uit S. cerevisiae dat beide processen de Sumo voorloper en desumoylates Sumo-geconjugeerde eiwitten12. We ontwikkelden de UTAG reagens gebaseerd op de toevallige observatie dat een mutatie van de katalytische cysteïne (C580S) in Ulp1’s SUMO verwerking ULP domain (UD) niet alleen voorkomt Sumo splitsing, maar ook vallen Sumo-geconjugeerde eiwitten met hoge avidity12. Voor de eenvoud, verwees we naar deze Carboxy-Terminal SUMO-trapping Ulp1 (C580S) fragment als UTAG (kort voor UD TAG). UTAG is een recombinant pan-SUMO het vangen proteïne die een nuttig alternatief voor anti-SUMO antilichamen vertegenwoordigt die voor de isolatie en de opsporing van SUMO-gewijzigde proteïnen worden gebruikt. Belangrijker, het erkent specifiek native-gevouwen, geconjugeerde SUMO en niet alleen een of meerdere epitopes op SUMO. Ter verbetering van zowel de eiwit stabiliteit en SUMO bindende kracht van UTAG, genereerden we een variant van UTAG uit de stress-tolerante gist Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG stevig bindt SUMO-geconjugeerden met nanomolar affiniteit13. Bovendien, kmUTAG is bestand tegen verhoogde temperaturen (42 °C), verminderende agenten (5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride), denatureringsmiddelen (tot 2 M ureum), oxyderende agenten (0,6% waterstofperoxyde), en niet-ionische detergentia. Deze stress tolerantie is gunstig tijdens de harde zuivering en langdurige incubatietijden, zorgen voor de stabiliteit en SUMO-trapping activiteit. Niet verrassend, echter, KmUTAG SUMO-trapping activiteit is onverenigbaar met cysteïne-wijzigen reagentia, Ionische detergenten en volledig gedenatureerde eiwitextracten. De opmerkelijke affiniteit en eigenschappen van KmUTAG geven aan dat dit reagens onderdeel kan worden van het standaard repertoire voor de studie van sumoylated eiwitten in meerdere soorten.
Hier bieden we een eenvoudige methode om SUMO-gemodificeerde eiwitten te detecteren in zoogdiercellen en nematoden met behulp van een recombinant fluorescerende mCherry-KmUTAG Fusion-eiwit (kmUTAG-FL).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier introduceren we het gebruik van kmUTAG-FL, een recombinant eiwit, voor functionele studies van SUMO in vaste zoogdiercellen en ontleed nematoden gonaden. KmUTAG-FL is een stress-tolerante pan-SUMO specifieke reagens dat herkent en vangt native SUMO-geconjugeerde eiwitten en SUMO ketens. Aangezien SUMO de tertiaire structuur is zeer behouden is het zeer waarschijnlijk dat SUMO varianten van extra model en niet-modelsystemen kunnen worden geanalyseerd met de kmUTAG-FL reagens. Als dusdanig, kan KmUTAG-FL een nuttig al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag alle leden van het Kerscher Lab bedanken voor hun steun, Nathalie Nguyen voor de kritische lezing van het manuscript, en Lidia EPP voor sequencing. Dit werk is ondersteund door de Commonwealth Research commercialisatie Fonds MF16-034-LS op OK. Ondersteuning van het onderzoek voor W & M studenten werd verzorgd door de Bailey-Huston onderzoek Fonds, en Charles Center eert beurzen aan RY en CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2′-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
