マウス心ペリサイトの単離と精製

すべての動物は、ラボアニマルケアインターナショナル(AAALAC)認定施設の評価と認定のための協会で収容され、使用され、すべての動物の仕事は、適切な獣医の監督の下で、機関動物の下で行われましたケアと使用委員会(IACUC)は、アムジェン社の承認されたプロトコル。 1. ツールと文化メディアの準備 オートクレーブ外科9 cmまっすぐな先端の細かいポイントはさみおよび10 cm斜めの鋸歯状の鉗子。 5%の胎児ウシ血清(FBS)の25 mLと1%ペニシリンストレプトマイシン(P/S)の5mLを、カルシウムマグネシウムフリーダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(CMF-DPBS)の500mLボトルに加えます。氷浴に溶液を入れ、使用時に冷たくなることを確認します。心臓の隔離のための50 mL円錐形の管にアリコット50 mL。50 mLアリコートにヘパリンナトリウム溶液を250単位/mL加えます。これをヘパリン化 CMF-DPBS と呼ばれます。 高グルコースダルベッコの改変ワシ培地(DMEM)の500 mLボトルに20S(100 mL)と1%P/S(5 mL)を加えます。これを酵素フリー培養培養培養といいます。DMEMのアリコート20 mL+20S+1%P/Sを加え、コラゲナーゼBの500 μg/mLに添加する。これを酵素溶液と呼ばれる。酵素フリー培養培養剤と酵素溶液の両方をインキュベーターまたは水浴で37°Cで温めます。 2. 動物の調製と心臓組織の調達 31G針注射器で250単位のヘパリンナトリウム溶液を用いたマウスを食後数食器内注射する。その後、マウスがホームケージでアクティブなままである間、10−15分待ちます。注:本研究の代表的なデータは、生後4ヶ月の雄C57BL/6マウスから得られた。しかし、このプロトコルは、歪み、年齢、性別、体重などに関係なく、任意のマウスで使用することができます。 5%のイソファランでマウスを麻酔する。ピンチ反射でマウスの麻酔深さを確認します。 麻酔マウスを上げ位置に置き、前肢をテープで留める。慎重に胸腔を開き、25 G蝶の針を使用して下降大小腸をカニューレします。 右心房にニックを作り、可変流動性ポンプで2mL/mininで250単位/mLヘパリン化されたCMF-DPBSの少なくとも20 mLで心臓を浸透させる。PBSが右のアトリアからきれいに出てくると、灌流が完了します。 大通りで心臓を切り取り、冷たいCMF-DPBSに入れます。 3. 心臓組織の解離 15 cm x 15 cm ペトリ皿に心臓を移します。スプリングハサミと細かい点鉗子を使って心臓を小片(1mm/個)に切り、細かい点鉗子を十分な酵素溶液で覆い(10−15 mL)。 50 mLの円錐形チューブにピースと溶液を移し、パラフィンプラスチックフィルムでシールし、75分間120rpmで軌道シェーカーで37°Cでインキュベートします。 酵素溶液でコラーゲナーゼ消化した後、100 μmセルストレーナーを通して液体を新しい50 mLチューブにデカントしますが、破片が乾燥しないように十分な溶液を残します。 細かい点鉗子を使用して、チューブから組織を取り出し、顕微鏡スライド上にいくつかの部分を置きます。その後、2つの顕微鏡スライドの間で組織を粉砕し、組織を分解する。酵素フリー培養培養物でスライドを新しい50 mL円錐管にすすいでください。 すべての組織片が解離されるまで、ステップ 3.4 を繰り返します。 ステップ 3.3−3.5のソリューションを1つのチューブに組み合わせます。得られた懸濁液を100 μmのセルストレーナーを通して、新しい50 mL円錐管にひずみます。 220 x g,4 °C,5分間の遠心分離機,前の溶液を吸引し、新鮮な酵素フリー培養培養培養培養中に細胞ペレットを穏やかに再中断します。 セルをカウントし、セル カウンタを使用して実行可能性を確認します。DPBSの500 mLと2−5%ウシ血清アルブミン(BSA)の10−25mLを含む冷たいFACS染色バッファーを用いて1 x 106/mLに細胞を希釈する。細胞は染色され、ソートされる準備ができています。 4. FACSを用いた粗細胞混合物からのペリサイトの精製 すべてのコントロールおよび細胞サンプルに対して5 mL FACSチューブを準備し、ラベルを付けます。無染色サンプルのアリコートアウト細胞(チューブ当たり細胞の1mL)、蛍光マイナス1(FMO)コントロール、およびアイソタイプ一致対照。並べ替えに残りのセルを使用します。すべてのコントロールおよびサンプルは同時に調製し、染色することができる。メモ：0.5 x 10の合計13 mL6細胞/mLは、1つの心臓からの代表的なソートに使用された。しかし、その量は、研究者が単離から得る細胞の数、使用する心臓の数、心臓組織が消化される程度によって異なります。各心臓のサイズは、音量を変更できる変数でもあります。蛍光補正制御を最適化するには、補償ビーズ(材料の表)を使用します。標識付きの5 mL FACSチューブで実験中の各フルオロクロムに対して1つの補償制御を準備します。この実験では、NG2-FITC、CD31-APC、CD140b-PE、CD146-BV605、CD34-BV421、CD45-PE-Cy7、および細胞生存率を含むマーカーパネルから2種類の無染色ビーズと7種類のフルオロクロムを加えた合計9種類の補償コントロールを準備します。材料のテーブル) 各チューブに圧行バイアルから補償ビーズ(約50μL)を1滴加えます。次に、ビーズに1 μLの抗体を添加します。マーカーパネルから抗体ごとに繰り返します。パルスボルテキシングで激しく混ぜます。光から保護された室温で残すことができる細胞生存率ビーズを除き、光から保護された4°Cで30分間インキュベートする。 次に、各チューブに3mLのFACS染色バッファーを加え、遠心分離機を300×gで4°Cで5分間加えます。 溶液を吸引し、FACS染色バッファーの400 μLで各ビーズペレットを再ステージングします。補正コントロールを使用する準備が整いました。氷の上にいろ FMO コントロールを使用して、スペクトルの重なりによる背景染色を最適化します。 FMOコントロールを調べ、5 mL FACSチューブのセクション4.1から引用された細胞の1 mLを使用し、ステップ4.1.1に記載のマーカーパネルからすべての抗体を1:100希釈で追加しますが、1つの抗体を除きます。例えば、CD31-APC、CD140b-PE、CD146-BV605、CD34-BV421、CD45-PE-Cy7、細胞生存率色素、NG2-AF488抗体用の抗体を含むことにより、NG2-AF488 FMOを調製する。パルスボルテキシングで穏やかに混ぜます。合計7対7の抗体について繰り返します。光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。 次に、各チューブに3mLのFACS染色バッファーを加え、遠心分離機を300×gで4°Cで5分間加えます。 溶液を吸引し、FACS染色バッファーの400 μLで各セルペレットを再ステージングします。FMO コントロールを使用する準備が整いました。氷の上にいろ 非特異的染色には、アイソタイプ一致対照抗体(材料表)を使用します。 アイソタイプ一致対照抗体(材料表)をセクション4.1から調製した細胞試料1mLに5mL FACSチューブ内の1:100希釈でそれぞれ添加することにより、アイソタイプコントロールを調製する。パルスボルテキシングで穏やかに混ぜます。光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。 次に、各チューブに3mLのFACS染色バッファーを加え、遠心分離機を300×gで4°Cで5分間加えます。 溶液を吸引し、FACS染色バッファーの400 μLで各セルペレットを再ステージングします。アイソタイプコントロールを使用する準備が整いました。氷の上にいろ 新たに単離した細胞に抗体カクテルを加えて選別する細胞を調用意する。 抗マウスNG2-AF488、CD31-APC、CD140b-PE、CD146-BV605、CD34-BV421、CD45-PE-Cy7を1:100希釈各1:100希釈および細胞生存率染色剤を含有する抗体カクテルに添加することにより、セクション4.1から細胞試料を調製する。穏やかに渦を混ぜる。光から保護された30分間、4°Cでサンプルをインキュベートします。 染色後、5分間300×gで遠心分離によりFACS染色緩衝液で細胞を洗浄する。溶液を吸引し、FACS染色バッファー内の細胞ペレットを0.5 x 106セル/mLに再ステージングします。 35 μmフィルタートップを持つ新しいFACSチューブを使用して、ピペット染色された細胞サンプルを蓋に、重力濾液を塗り、単一細胞懸濁液を得ます。氷の上にいろ 細胞ソーターを使用して細胞を浄化します。 セルソーター上の汚れていないセルを実行して電圧を設定し、バックグラウンド信号に対して補正します(たとえば、前方散乱の電圧を490−560に設定し、サイドスキャッタを180−250に設定します)。 各単色補正ビーズサンプルを一度に1つずつ実行して、各チャンネルの電圧を調整し、正の信号のゲートを調整します。データを収集します。補正行列を計算することにより、スペクトルの重複を計算するソフトウェアを使用します。すべての電圧は準備ができて設定されています。 各アイソタイプコントロールを一度に1つずつ実行し、このデータを使用して、非特異的なバインディングがある場合はゲートを調整できます。 各FMOサンプルを一度に1つずつ実行し、各チャンネルの電圧を調整して、マルチカラーパネルによるスペクトルブリードを補正します。 細胞選別機で染色された細胞サンプルを実行し、15 mL円錐採取管内の10mL酵素フリー培養培養培養物(DMEM + 20S + 1%P/S)で細胞を集集める。単一細胞のゲート、生細胞用ゲート、CD45陰性細胞のゲート、CD34およびCD31陰性細胞のゲート、NG2陽性細胞のゲート、最後にCD146およびCD140b陽性細胞のゲートを使用します。 5. ペリサイトの培養 ゼラチンを0.2%のゼラチンで24ウェルプレートに5分間塗り、ゼラチン溶液を吸引します。DMEMのステップ4.2.5から新たに得られた細胞をシード + 20% FBS + 1% P/Sまで 2 x 104細胞/cm2.37°C、5%CO2および95%O2に設定された細胞インキュベーター中の培養細胞。 ペリサイトの通過 細胞が95%のコンフルエントになったら、暖かい1x DPBSで細胞を洗浄し、200 μLの0.1%トリプシンを室温で3-5分間持ち上げます。 プレートを軽くタップして細胞を緩めます。 培養培地量の3.5倍(700μL DMEM+ 20S + 1% P/S)と種子通路2(P2)細胞を2 x 104細胞/cm2にコーティングされていない6ウェルプレート上に3.5倍で中和する。 各ウェルは、コンフルエントの場合、P3細胞として単一のT-75フラスコに移動することができ、その後1:6比で分割することができる。 6. ペリサイトの特徴付け フローサイトメトリー分析 前述のセクション 4 と同じ FACS 染色プロトコルとゲーティング戦略を使用します。 フローサイトメーターでコントロールと染色されたサンプルを実行します。分析ソフトウェア (材料の表) を使用してデータを収集し、データを分析します。 明るい画像を収集するには、37 °C、5%CO2および95%O2に設定されたセルインキュベーターでフラスコ内の細胞を成長させる。細胞が表面に付着した後、顕微鏡で画像をキャプチャします。 免疫細胞化学 96ウェルプレートで細胞を90%コンフルエントになるまで成長させます。温かい1x DPBSで細胞を洗浄し、室温で30分間4%のパラホルムアルデヒドで固定します。 細胞を1x DPBSで3倍洗い、0.1%の洗剤で10分間透過させます。 室温で1時間のブロッキングバッファーで細胞をインキュベートします。遮断後、一次抗体(ウェル当たり1抗体)をブロッキングバッファーに1:100希釈し、一晩4°Cでインキュベートする。一次抗体は、抗NG2、抗CD140b、抗CD31、抗ビメンチン、抗デスミン、および抗α平滑筋アクチンである。 翌日、洗浄バッファーで細胞を3倍に洗浄する(材料の表)。ブロッキングバッファーに希釈した二次抗体を1:1,000に添加し、暗闇の中で室温で2時間インキュベートする。二次抗体はFITCに結合した抗ウサギである。 洗浄バッファーで細胞を3倍洗う。室温で5分間、1:1,000で希釈した300μMの核汚れを加えます。 1x DPBSでセル3xを洗浄し、マウントメディアでマウントします。 共焦点顕微鏡を用いて画像細胞。