عزل وتنقية البيريكيتالقلبي ة المورين
Summary
لقد قمنا بتحسين بروتوكول لعزل وتنقية البيريسيتات القلبية للمورين للبحث والتحقيق الأساسي في البيولوجيا والإمكانات العلاجية.
Abstract
ومن المعروف أن البيريسيس، والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية من الأوعية الدقيقة والشعيرات الدموية، تلعب دورا في تكوين الأوعية الدموية، وتثبيت الأوعية، وسلامة الحاجز البطانية. ومع ذلك، وظائفها الخاصة بالأنسجة في القلب ليست مفهومة جيدا. وعلاوة على ذلك، لا يوجد حاليا أي بروتوكول يستخدم مواد يسهل الوصول إليها لعزل وتنقية البيريسيتات ذات المنشأ القلبي. يركز بروتوكولنا على استخدام نموذج الثدييات المستخدم على نطاق واسع، الماوس، كمصدر للخلايا. باستخدام الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي لأنسجة القلب، حصلنا على خليط الخلايا الخام التي تم تنقيتها بشكل أكبر عن طريق تنشيط الفلورة فرز الخلايا (FACS) من قبل عدد كبير من العلامات. لأنه لا يوجد علامة واحدة لا لبس فيها لpericytes، ونحن مسور للخلايا التي كانت CD31–CD34–CD45–CD140b+NG2+CD146+ . بعد التنقية، تم زراعة هذه الخلايا الأولية ومرورها عدة مرات دون أي تغييرات في المورفولوجيا والتعبير علامة. مع القدرة على الحصول بانتظام على pericytes القلب المورين الأولية باستخدام بروتوكولنا، ونأمل في مزيد من فهم دور pericytes في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية وإمكاناتها العلاجية.
Introduction
تحيط الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية المعروفة باسم pericytes بالسفن الدقيقة والشعيرات الدموية لشجرة الأوعية الدموية1،2. من الناحية الفسيولوجية، ومن المعروف أنها تعزز وتلعب دورا في تكوين الأوعية الدموية، وزيادة سلامة الحاجز بسبب علاقتها الوثيقة مع الخلايا البطانية، فضلا عن استقرار ونضج الأوعية1،2. وعلاوة على ذلك، فإن الخلل و / أو فقدان هذه الخلاياقد تورطت في أمراض مثل مرض الزهايمر 2،3 وأمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة4. توجد هذه الخلايا في جميع أنحاء الجسم بأكمله، ولكن أرقام الخلايا تعتمد على الأنسجة. وقد درست Pericytes أبرزها في الدماغ بسبب ارتفاع الأوعية الدموية من حاجز الدم في الدماغ1،2. ومع ذلك، في القلب، يتم دراسة بيولوجيا البيريكيت بشكل ناقص.
في الآونة الأخيرة، هناك مصالح متزايدة في هذا المجال لpericytes القلب، ولكن لا يوجد حاليا بروتوكول مبسط المتاحة لعزلها عن واحدة من الأدوات الأكثر استخداما في علم الأحياء – الماوس. هناك بروتوكولات في الأدب على عزل pericytes من الدماغ5, شبكية العين6, المشيمة7, والعضلات الهيكلية8,9; ومع ذلك، هناك عدد قليل من البروتوكولات على عزل pericytes من القلب. هناك العديد من المجموعات التي عزلت pericytes القلب. وقد تمكن نيس وآخرون من عزل كمية وفيرة من البيريسيتات القلبية عن أنواع متعددة بما في ذلك الفأر؛ ومع ذلك، فإن أساليبها تستخدم معدات محددة في المنزل بنيت مما يقلل من استنساخ10. Avolio et al.11,Chen et al.12,and Baily et al.13 successfullyy ayytes من أنسجة القلب البشرية, ولكن الأنسجة البشرية ليست دائما متاحة ويصعب الحصول عليها لبعض المحققين. هنا، قمنا بتطوير طريقة العزل للحصول على pericytes القلب من نماذج الماوس للمحققين لمواصلة دراسة البيولوجيا مع المواد المتاحة بسهولة.
باستخدام الهضم الأنزيمي والفلورة تنشيط فرز الخلايا (FACS) مع علامات البيريكيت الرئيسية المعروفة14، يسمح لنا بروتوكولنا بعزل وتنقية مجموعة من البيريكيت التي تتميز CD31–CD34–CD45– CD140b+NG2+CD146+. تحتوي لوحة علاماتنا على علامات التضمين والاستبعاد على حد سواء. يستخدم CD45 كعلامة لاستبعاد خلايا المكونة للدم. يتم استخدام CD31 كعلامة لاستبعاد الخلايا البطانية. يستخدم CD34 كعلامة لاستبعاد كل من خلايا التبويائية وبطانة الرحم. CD146 هو علامة للخلايا المحيطة بالأوعية الدموية. وأخيرا، NG2 وCD140b (المعروف أيضا باسم الصفائح الدموية المستمدة مستقبلات عامل النمو بيتا – PDGFRβ) هي علامات مقبولة على حد سواء لpericytes14. يمكن أن تكون الثقافة الأساسية التي تم الحصول عليها مستوّلة ومرورها عدة مرات دون أي تغييرات في المورفولوجيا أو تعبير العلامة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه الخلايا مشتركة مع الخلايا البطانية لدراسة تفاعلاتها والكلام المتبادل مع بعضها البعض. هذه الطريقة عزل الخلية سوف تسمح للمحققين لدراسة البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية من pericytes القلب من نوع البرية, المرض, ونماذج الماوس متغير وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبما أن الدراسات المتعلقة بpericytes القلبية جديدة نسبياً، فإن دور البيريسيتات في علم وظائف الأعضاء القلبية الوعائية والفيزيولوجيا المرضية لم يُحدد بعد. في أجهزة أخرى، وقد ثبت أنها تلعب أدوارا رئيسية في الهومنة السفينة والتسريب1،2. بالمقارنة مع أدب pericytes من أجهزة أخرى مثل الدماغ، وهناك عدد أقل بكثير من المنشورات على pericytes القلب. إن عزل البيريسيتات القلبية أمر بالغ الأهمية لفهم خصائصها الوظيفية وآليات الإشارة. ولذلك، فإن هذا البروتوكول يوفر للمحققين طريقة أسهل للوصول إلى pericytes القلب من مصدر الأنسجة المتاحة بسهولة أكبر وتعزيز الدراسات على البيولوجيا الخاصة بهم. وسوف يساعد على الإجابة على الأسئلة حول كيفية مساهمة pericytes القلب في التوازن القلبي والفيزيولوجيا المرضية، فضلا عن التحقيق في إمكاناتها العلاجية.
السكان pericyte معزولة عن قلب المورين وتتميز CD31–CD34–CD45–CD140b+NG2+CD146+ تم تمريرعدة مرات (تصل إلى P12 وكان لا يزال قويا)، والتي لا انخفاض في القدرة على البقاء وينتشر بسرعة (الشكلالتكميلي2). كما تم تجميد الخلايا بالتبريد واستعادتها مع ما لا يقل عن 95٪ من الجدوى. ومع ذلك، نحن نفضل استخدام الخلايا P7 أو أصغر لتجاربنا. مقارنة الصور brightfield من pericytes لدينا مع pericytes الدماغ البشري، وخطوط الخلية اثنين لديها مورفولوجيا الخلية مماثلة (الشكل4A)في حين أنها تختلف في مورفولوجيا من خلايا العضلات الملساء (الشكل4A). تتميز خلايا P7 لدينا بالكيمياء المناعية لعلامات pericyte، وبعضها من لوحة FACS لدينا (NG2 و CD140b)، وعدد قليل ليس في لوحة (vimentin، desmin، αSMA) ووجدنا أن الخلايا أعرب علامات pericyte متجانسة (الشكل 4B). بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل خلايا P7 لدينا عن طريق قياس التدفق مرة أخرى مع نفس لوحة علامة لتقييم التغييرات في التعبير علامة بسبب تمرير ووجدنا أنه لم تكن هناك تغييرات (الشكل4C). لذلك، على حد سواء فينيولاولوجيولوجي، خلايانا هي pericytes.
وقد أظهرت الدراسات التي أجراها نيس وآخرون10وAvolio وآخرون11وChen et al.12وBaily et al.13 عزلات القلب البيريسيت الناجحة. ومع ذلك، فإن استخدام المعدات المبنية حسب الطلب في المنزل لفصل البيريسيتات عن السفن الدقيقة من قبل نيس وآخرون10 ينطوي على غرفتين مع المضخات التي تغرس محلول البروتياز ذهابا وإيابا من خلال كومة شبكة الشبكة، والتي كان من الصعب تكرارها لأنها لم يقدم تخطيطية و / أو صورة للجهاز وكيف تم بناؤه. على الرغم من أن Nees وآخرون10 عزل بنجاح pericytes القلب من العديد من الأنواع، ونحن لم تكن قادرة على إعادة إنتاج طريقتهم. لدينا خطوة مفرزة pericyte في بروتوكولنا يستخدم ببساطة شاكر المدارية (لفصل جميع الخلايا) التي تتوفر في معظم، إن لم يكن كل المختبرات، مع الأنسجة ومحلول الإنزيم في أنبوب مخروطي تليها خطوة التفكك الميكانيكية. لا يوجد جهاز مخصص مطلوب. ثانيا، تنطوي البروتوكولات المتبقية على استخدام الأنسجة البشرية، وبالتالي فإن شراء الأنسجة البشرية يقتصر على المحققين. بروتوكولنا هو تعديل وتحسين البروتوكولاتالحالية 9،12 باستخدام نماذج الماوس (نوع البرية، المعدلة وراثيا، والمرضى) والمواد التي هي متاحة بسهولة لجميع المحققين.
نظرًا لأن الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية بشكل عام حساسة، فإن بقاء الخلايا أمر بالغ الأهمية للحصول على عائد جيد. أثناء شراء أنسجة القلب وتلطيخ الخلايا، تحتاج الأنسجة / الخلايا إلى أن تبقى باردة. ثانيا، قد يتطلب الهضم الأنزيمي للأنسجة التحسين على أساس فردي. اعتمادا على وحدات النشاط على قارورة واحد من الإنزيمات، والتركيز والهضم الوقت قد تحتاج إلى الأمثل. تأكد من أن يتم إعداد الحل الأنزيمي الطازجة في كل مرة خلاف ذلك سوف ينخفض العائد. ثالثا، يحتوي الخليط الخام على الكثير من الخلايا، وبعضها ميت و/ أو يحتضر، فمن الأفضل لخفض تركيز FBS في المخزن المؤقت تلطيخ من 5٪ إلى 2٪. إذا كنت تواجه مشكلة مع الخلايا انسداد فوهة أثناء الفرز، إثراء الخلايا أولاً باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة. يمكنك أيضًا إضافة المخزن الاحتياطي EDTA/HEPES أو علاج DNase إلى فرز الخلايا المسبق لمنع تكتل الخلايا. وأخيرا، لأن لدينا لوحة من الأجسام المضادة كبيرة نوعا ما ويستخدم العديد من الفلوروفوريس، تأكد من أن يتم التحكم FMO الخاص بك وضوابط التعويض بشكل صحيح.
أحد القيود على هذه الطريقة هو كمية pericytes القلبية التي يمكن الحصول عليها لكل قلب. في حالتنا، فقط 1.1٪ من خليط نا الخام من قلب فأر واحد كانت pericytes التي هي مماثلة للنسبة المئوية في انعزالات القلب البشري، ولكن عدد الخلايا أقل بكثير بسبب كمية أنسجة القلب التي يوفرها الماوس. لأن عدد بدء الخلايا منخفضة جدا بعد FACS، سيكون من الأفضل عزل من قلوب متعددة في وقت واحد. ومع ذلك، فإن المشكلة مع ذلك هو مجرد عدد من الخلايا التي تحتاج إلى فرز من خلال في يوم واحد. إذا كان لديك أكثر من 30 مليون خلية، سيكون من الصعب الحصول من خلال هذا النوع دون التأثير على صلاحية الخلايا. إذا كان المحقق لديه عدة فرز اتّساع خلايا، فإن العزل عن قلوب متعددة في يوم واحد سيكون قابلاً للتنفيذ. قيود أخرى هي أننا لا نعرف ما إذا كان هناك مجموعات فرعية من pericytes في القلب مثل هناك العضلات الهيكلية15،16، ونحن لا نعرف ما إذا كنا القضاء على نوع فرعي في استراتيجيتنا gating. نحن في عملية وصف pericytes القلب لدينا وحتى الآن في بياناتنا غير المنشورة، فهي وظيفية مثل pericytes الأخرى في الأدب.
سيمكن بروتوكولنا المحققين من الإجابة على الأسئلة المتعلقة بخصائص القلب، والخصائص، والوظائف، والجوانب الأخرى التي من شأنها أن تساعد في تحديد مساهمتهم في التوازن القلبي وديناميكا القلب. هذه الخلايا يمكن أن يكون لها القدرة العلاجية لأمراض القلب والأوعية الدموية بمجرد فهم بيولوجيا بشكل أفضل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا Amgen Flow Cytometry Core على مساعدتهم في تصميم لوحة الفلوروفور، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، وفرز الخلايا.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
| 100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
| 15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| 25 gauge butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
| 31 gauge needle syringe | FisherSci | B328446 | |
| 50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
| Brightfield Microscope | camera attached | ||
| CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Centrifuge | eppendorf | ||
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
| Confocal Microscope | |||
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
| DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
| Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
| Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| FACSAria software | BD | ||
| Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
| Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
| Fine scissors | FST | 14060-09 | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | ||
| Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
| Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
| Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
| Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
| Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
| Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
| NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
| Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
| Pipette and tips | |||
| ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
| Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
| Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody – FITC |
| Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody – APC |
| Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody – BV421 |
| Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody – BV605 |
| Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody – PE |
| Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody – PE-Cy7 |
| SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
| T75 | ThermoFisher | 156499 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
| UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
| ViCell Cell counter | Beckman | ||
| Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |
References
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Sengillo, J. D., et al. Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer’s disease. Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).
- Avolio, E., Madeddu, P. Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease. Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).
- Dore-Duffy, P. Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes. Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).
- Bryan, B. A., D’Amore, P. A. Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models. Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. Perivascular cells for regenerative medicine. Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Avolio, E., et al. Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease. Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043 (2015).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Baily, J. E., et al. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. Journal of Visualized Experiments. (116), e54252 (2016).
- Murray, I. R., et al. Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
