Serbest yüzen Immünofluorescence tahlil ile kutanöz periferik sinir lifleri Alfa Synuclein toplamları hedefleme
Summary
Burada, biz Parkinson hastalığı ve multipl proteinleri dahil Alfa Raisin hastalığın spesifik konformasyon türevleri tanımlanması için izin cilt biyopsisi bölümlerde serbest yüzen dolaylı immünofluorescence tahlil için bir protokol sunuyoruz Periferik sinir sistemi.
Abstract
Bugüne kadar, çoğu nörodejeneratif hastalıklar için sadece bir post-mortem histopatolojik kesin tanı mevcuttur. Parkinson hastalığı (PD) için, tanı hala sadece hastalık kursunda daha sonra görünür motor tutulumu klinik belirtileri dayanır, dopaminerjik nöronların çoğu zaten kaybolduğunda. Bu nedenle, hastalığın başlangıcında veya onu geliştirme riskinde hastaları tanımlayabilir bir biyomarker için güçlü bir ihtiyaç vardır. Son birkaç yıl içinde, cilt biyopsisi, küçük lif nöropati gibi periferik sinir hastalıkları için mükemmel bir araştırma ve tanı aracı olduğunu kanıtladı. İlginç bir şekilde, PD hastalarında cilt biyopsisi ile küçük lif nöropati ve Alfa Raisin (αsyn) nöral tortuları gösterildi. Nitekim, cilt biyopsisi, patolojiye eğilimli periferik sinir dokusunun analizini sağlayan, kolayca erişilebilen, minimal invazif ve ağrısız bir prosedür olmanın büyük avantajına sahiptir. Dahası, aynı hastanın takip esnasında deri biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesi ile uzunlamasına korelasyon incelenmesi sağlar. PD hastasının cilt sinir lifleri içinde αSyn toplamaların varlığını araştırmak için standardize edilmiş güvenilir bir protokol kuracağız. Bu protokol, birkaç kısa sabitleme adımlarını, bir cryotome bölümlendirmesini ve daha sonra iki spesifik antikorla serbest yüzen immünofluorescence çift lekeleme içerir: Anti protein gen ürün 9,5 (PGP 9.5) tespit için kutanöz sinir lifleri ve anti 5G4 işaretlemek için αSyn toplamları. Bu da cilt sinirleri ilgi diğer proteinlerin hedefleme için uygulanabilir bir çok yönlü, hassas ve kolay bir protokoldür. ΑSyn toplamalarını işaretleme yeteneği, PD ‘nin önceden mortem histopatolojik tanısı oluşturmak için bir araç olarak cilt biyopsisi kullanımı için bir adım daha ileri bir adımdır.
Introduction
Cilt biyopsisi nörolojik bozukluklar alanında teşhis ve araştırma aracı olarak büyük önem kazanmıştır1. Nitekim, epidermis ve dermis bol somatik duyusal sinir lifleri (myelinated ve myelinated), nociceptif serbest sinir sonlar, duyusal reseptörleri ve ter bezleri, damarların, yağ bezleri ve kas arrektor leiomiyomlardır otonoma innervasyonu içerir 2‘ ye kadar.
Orta-20inci yüzyılda, PGP 9.5 antikor immünhistokimya için kurulum insan epidermis memelinin deri3geniş bir innervasyon kanıtı izin verdi. PGP 9.5, hem merkezi hem de periferik sinir sisteminin (PNS) akons boyunca eşit olarak dağıtılan bir karboksil-Terminal hidrolaz ‘dir. Bu antikor mevcudiyeti sadece cilt PNS Morfoloji ve anatomisini açıklığa kavuşturmak için izin değil, aynı zamanda bu ile ilişkili hastalıkların çalışma uygulanan3,4. Cilt biyopsisi yeni bir klinik obje tanımlamak için katkıda bulunmuştur: küçük lif nöropati. Çeşitli uluslararası gruplar intraepidermal sinir lifleri ve belirtiler/küçük lif nöropati belirtileri kaybı arasındaki ilişkiyi göstermiştir5 cilt biyopsisi analizi ile ve sinir morfometri için standart protokoller sağlanan yanı sıra klinik uygulamada kullanılmak üzere normatif referans değerleri6,7,8.
Son zamanlarda büyük miktarda kanıt, nörodejeneratif hastalıkların, merkezi sinir sistemindeki yanlış katlanan protein birikimleri ile karakterize olduğunu göstermiştir, Multi-sistem patolojileri9. Gerçekten de, PD, kanıtlanmışdopaminerjik nöron içinde αsyn birikimi ile karakterize, ancak αsyn ve patolojik formu, fosforile αsyn (P-αsyn), periferik dokularda da tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Gastro-intestinal mukoza10, tükürük bezleri11, ter bezleri ve pilomotor kasları çevreleyen cilt otonjik lifleri12,13,14, αsyn patojen formları için immünoreactivity göster, Braak hipotezi ile ilgili olarak, αSyn patolojisinin beyinde birikiminden önce, PNS ‘de önceden de başlayabilir. Dahası, p-αsyn varlığı, prodromal PD olarak kabul edilen REM davranış bozuklukları olan hastaların cilt sinirinde gösterildi16,17 böylece deri patolojik αsyn umut verici bir erken periferik olarak kabul edilebilir synucleinopati histopatolojik Marker.
PD ‘de küçük lif nöropati Birliği daha önce gösterildi ve intraepidermal sinir liflerinin yoğunluğu hastalığın ilerlemesini yansıtan bulunmuştur18,19. Bu nedenle, cilt biyopsisi PD ‘de nörodejenerasyonun incelenmesi ve hastalığın ön mortem histopatolojik tanısı oluşturmak için yararlı bir araçtır. Nitekim, cilt biyopsisi, patolojiye eğilimli sinir dokusunun analizine izin vererek kolayca erişilebilen ve minimal invaziv bir prosedür olmaktan büyük bir avantaj sağlar. Son olarak, aynı hastaların takip esnasında deri biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesi ile uzunlamasına korelasyon incelenmesi sağlar.
Laboratuvarımızda, PGP 9.5 ve konformasyon özel monoklonal 5g4 antikor ile çift immüno-boyama sömürüyor, bu αsyn küçük agrega dahil hastalık spesifik formları tanır20,21, biz göstermek başardık umut verici yüksek tanı verimliliği ile cilt sinirleri αSyn toplamları varlığı19. Konformasyonel hastalıklarda cilt biyopsisi immünofluorescence Analizi hem protein agregaları tespiti hem de nörodejenerasyonun ölçüleri arasında kombine edilerek, umut verici bir biyomarkerlerin kaynağı olarak öne çıkmaktadır. Bundan sonra, cilt biyopsisi ile ilgili kolay ve çok yönlü bir protokol gösteriyoruz ve αSyn toplamalarını tespit etmek için serbest yüzen immünofluoresesans lekesini gerçekleştirme. Dahası, bu protokol cilt PNS ifade ilgi diğer protein hedefleme için adapte edilebilir.
Aşağıdaki çalışma protokolü, pH ‘nin PNS ‘inde toplanan αSyn analizinin tanı yardımcı programını cilt biyopsisi19ile değerlendirmek için kullanılmıştır. PD için dahil etme kriterleri: INGILTERE beyin Bankası teşhis kriterlerine göre kesin bir klinik tanı, hastalık süresi en az 3 yıl, hiçbir aile öyküsü, ve önemli bir bilişsel bozukluk ya da tarihin önemli dysautonomic belirtileri. Dışlama kriterleri nöropati nedenleri bilinen (glycated hemoglobin, kreatinin, B12 vitamini, TSH, serum immünofixation, HıV, HCV, frengi, ve borreliosis). Her konu üç anatomik bölgelerde 3 mm çapında cilt biyopsileri (C8 dermatomal seviyede boyun, diz üstünde uyluk 10 cm, lateral Malleolus üzeri bacak 10 cm) ve klinik olarak daha etkilenmiştir. Genel olarak, aşağıdaki protokol cilt biyopsisi işleme ve serbest yüzen immünofluorescence boyama ve analiz gerçekleştirme hakkında. Bu nedenle adapte edilebilir ve cilt dokusu ilgi diğer proteinlerin tespiti için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz PD tanısı için cilt biyopsileri için serbest yüzen immünofluorescence tahlil tarif: Bu anti-PGP 9.5 antikor, bir panaxonal Marker ve anti-5G4, toplanan formu tanıyan bir konformasyon spesifik antikor ile çift immünostasyonu istismar , αSyn.
PH ‘de tanı amacı ve muhtemelen diğer protein Konformasyonel bozukluklarda cilt biyopsisi için büyük avantajlar şunlardır: 1) hafif invazif bir teknik ile hastalığa eğilimli sinir dokusuna doğrudan erişim ve böylece beklenen daha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın mali desteği için Parkinson Schweiz ve ABREOC (Ente Ospedaliero Cantonale bilimsel araştırma Danışma Kurulu) teşekkür ederiz.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist’s Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. . Skin. , 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al. Nerve endings in mammalian skin. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson’s disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson’s disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson’s disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
