Ориентация Альфа Синуклеин Агрегаты в кожных периферных нервных волокон по свободно плавающей иммунофлуоресценции Анализ
Summary
Здесь мы представляем протокол для свободно плавающей непрямой иммунофлуоресценции анализ на биопсии кожи разделов, что позволяет для выявления болезни конкретных вариантов конформации альфа-синуклеина, участвующих в болезни Паркинсона и несколько белков периферической нервной системы.
Abstract
На сегодняшний день для большинства нейродегенеративных заболеваний доступна только посмертная гистопатологическая диагностика. Для болезни Паркинсона (PD), диагноз по-прежнему опирается только на клинические признаки двигательной участия, которые появляются позже в течение болезни, когда большинство дофаминергических нейронов уже потеряны. Таким образом, существует острая потребность в биомаркере, который может идентифицировать пациентов в начале заболевания или на риск его развития. За последние несколько лет биопсия кожи оказалась отличным исследовательским и диагностическим инструментом для периферических заболеваний нервов, таких как небольшая клетчатка невропатии. Интересно, что небольшие волокна невропатии и альфа-синуклеин (Зин) нервных отложений были показаны биопсии кожи у пациентов PD. Действительно, биопсия кожи имеет большое преимущество быть легкодоступной, минимально инвазивной и безболезненной процедурой, которая позволяет анализировать периферические нервные ткани, склонные к патологии. Кроме того, возможность повторения биопсии кожи в ходе наблюдения за тем же пациентом позволяет изучать продольную корреляцию с прогрессированием заболевания. Мы создали стандартизированный надежный протокол для исследования наличия агрегатов «Syn» в волокнах нервов кожи пациента PD. Этот протокол включает в себя несколько коротких шагов фиксации, криотомосирование, а затем свободно плавающей иммунофлуоресценции двойное окрашивание с двумя конкретными антителами: анти протеин ген продукт 9.5 (PGP9.5), чтобы отметить кожные нервные волокна и анти 5G4 для обнаружения «Синтез агрегаты. Это универсальный, чувствительный и простой в исполнении протокола, который также может быть применен для ориентации других белков, представляющих интерес для нервов кожи. Способность маркировать агрегаты «Syn» является еще одним шагом вперед к использованию биопсии кожи в качестве инструмента для установления предсмертной гистопатологической диагностики PD.
Introduction
Биопсия кожи приобрела большое значение в качестве диагностического иисследовательского инструмента в области неврологических расстройств 1. Действительно, эпидермис и дерма содержат обильные соматические сенсорные нервные волокна (миелинированные и немиелинированные), ноцицептивные свободные нервные окончания, сенсорные рецепторы и вегетативную инвенвацию потовых желез, сосудов, сальных желез и мышечных арфистых пилорумов 2.
В середине 20-го века, установка для иммуногистохимии PGP9.5 антитела позволили доказательства обширной иннервации человеческой эпидермис кожи млекопитающих3. PGP9.5 представляет собой карбоксило-терминальную гидролазу, равномерно распределенную по аксонам как центральной, так и периферической нервной системы (PNS). Наличие этого антитела позволило не только прояснить морфологию и анатомию PNS в коже, но и внедрить исследование заболеваний, связанных с ней3,4. Биопсия кожи способствовала определению новой клинической сущности: мелкой клетчатки невропатии. Несколько международных групп продемонстрировали связь между потерей интраэпидермальных нервных волокон и симптомами/признаками мелкой клетчатки невропатии5 анализом биопсии кожи и предоставили стандартизированные протоколы для нервной морфометрии, а также нормативные эталонные значения, которые будутиспользоваться в клинической практике 6,7,8.
В последнее время большое количество доказательств показало, что нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся неправильно сложенными накоплениями белка в центральной нервной системе, являются многосистемными патологиями9. Действительно, PD характеризуется накоплением син в дофаминергическом нейроне substantia nigra,но было продемонстрировано, что «Син и его патологическая форма, фосфорилированный син (P-‘Syn), могут быть обнаружены также в периферических тканях. гастро-кишечная слизистая оболочка10, слюнные железы11, кожа вегетативных волокон, окружающих потовые железы и пиломоторные мышцы12,13,14, показать иммунореактивность к патогенным формам Syn, в в соответствии с гипотезой Браак, что интригующе постулировать, что патология syn может начаться в PNS заблаговременно, до его накопления в мозге15. Кроме того, наличие р-Зсин было продемонстрировано в кожных нервах пациентов с расстройствами поведения REM, которые считаются продромальными PD16,17 таким образом, патологический кожный синтез можно считать перспективным ранним периферическим гистопатологический маркер синуклейнопатии.
Связь мелкого волокна невропатии в PD было продемонстрировано ранее, и было установлено, что интраэпидермальные нервные волокна плотность отражает прогрессирование заболевания18,19. Таким образом, биопсия кожи является полезным инструментом для изучения нейродегенерации в PD и для установления досмертной гистопатологической диагностики заболевания. Действительно, биопсия кожи имеет большое преимущество в том, что легко доступная и минимально инвазивная процедура, позволяющая анализировать нервную ткань, склонную к патологии. Наконец, возможность повторения биопсии кожи в ходе наблюдения за теми же пациентами позволяет изучать продольную корреляцию с прогрессированием заболевания.
В нашей лаборатории, используя двойное иммуно-окрашивание с PGP9.5 и конформации конкретных моноклональных 5G4 антитела, что признает болезни конкретных форм “Syn в том числе малых агрегатов20,21, мы смогли показать наличие агрегатов «Syn» в кожных нервах с перспективной высокой диагностической эффективностью19. Иммунофлуоресценция анализ биопсии кожи при конформационных заболеваниях выделяется как перспективный источник биомаркеров, сочетая как обнаружение белковых агрегатов, так и меру нейродегенерации в vivo. Далее мы иллюстрируем простой и универсальный протокол по обработке биопсии кожи и выполнению свободно плавающего иммунофлуоресцентного окрашивания для обнаружения агрегатов Syn. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для ориентации любого другого белка, интересуемого в коже PNS.
Следующий протокол исследования был использован для оценки диагностической полезности агрегированного анализа Syn в PNS PD по биопсии кожи19. Критерии включения для PD были: определенный клинический диагноз в соответствии с диагностическими критериями Банка мозга Великобритании, продолжительность заболевания по крайней мере 3 лет, нет семейной истории, и никаких серьезных когнитивных нарушений или основных дистоветномических симптомов в истории. Критериями исключения были известны причины невропатии (гликированный гемоглобин, креатинин, витамин В12, ТТГ, иммунофиксация сыворотки, ВИЧ, ВГС, сифилис и боррелиоз). Каждый предмет прошел 3 мм-диаметр биопсии кожи на трех анатомических участках (шея на дерматомном уровне C8, бедро 10 см выше колена, нога 10 см выше боковой malleolus) на стороне, которая была клинически более пострадавших. В целом, следующий протокол об обработке биопсии кожи и выполнения свободно плавающей иммунофлуоресцентности окрашивания и анализа. Поэтому его можно адаптировать и использовать для обнаружения других белков, представляющих интерес в тканях кожи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем свободно плавающий иммунофлуоресценционный анализ биопсии кожи для диагностики PD: он использует двойное иммуносохранение с анти-PGP9.5 антитела, panaxonal маркер, и анти-5G4, конформации конкретных антител, который признает агрегированной форме из «Син».
Большие пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Паркинсона Швейза и ABREOC (Консультативный совет по научным исследованиям Кантонале Энте Оспедедеро) за финансовую поддержку этого исследования.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist’s Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. . Skin. , 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al. Nerve endings in mammalian skin. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson’s disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson’s disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson’s disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
