Технический аспект автоматизированного синтеза и кинетической оценки в реальном времениNo 11C'SNAP-7941
Summary
Здесь мы представляем протокол для полностью автоматизированной радиомаркировкиNo 11C’SNAP-7941 и анализа кинетики в реальном времени этого ПЭТ-трассировщика на P-gp выражении и невыразительных клетках.
Abstract
Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) является важным методом молекулярной визуализации, обеспечивающим понимание путей и использование конкретных целевых радиолигандов для исследований in vivo. В рамках этого протокола описан надежный и надежный дистанционно управляемый радиосинтезNo 11C’SNAP-7941, антагонист к рецептору гормона, концентрирующего меланин 1. Радиосинтез начинается с циклотрона, произведенногоNo 11C’CO 2, который впоследствии дополнительно реагирует с помощью газофазного перехода кNo 11C’CH3OTf. Затем этот реактивный промежуточный вводится в раствор-предшественник и формирует соответствующий радиотрейстер. Химическая, а также радиохимическая чистота определяются с помощью RP-HPLC, регулярно внедряемого в процессе контроля качества радиофармацевтических препаратов. Кроме того, активность моляра рассчитывается так как она является необходимостью для следующих кинетарных исследований в реальном времени. Кроме того, для оценки влияния Экспрессии P-гликопротеинов (P-gp) на накопление клеток применяется11C’SNAP-7941. По этой причине, P-gp экспрессии клеточной линии (MDCKII-hMDR1) либо используется без или с блокированием до экспериментов с помощью P-gp субстрата (я)-вераполила и результаты сравниваются с теми, наблюдается для клеток дикого типа. Общий экспериментальный подход демонстрирует важность точного тайм-менеджмента, который необходим для каждого доклинического и клинического исследования с использованием ПЭТ-трассировок, оснащенных недолговечными нуклидами, такими как углерод-11 (половина жизни: 20 мин).
Introduction
11С. SNAP-7941 был разработан в качестве первого позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)-трассировщик ориентации меланина концентрации гормона рецептора 1 (MCHR1) – рецептор в основном участвует в центральной регуляции аппетита и потребление пищи1. Углерод-11 маркировки SNAP-7941, хорошо характеризуется MCHR1 антагонист, дали подлинный ПЭТ-трейсер2,3,4,5. Тем не менее, полностью автоматизированный радиосинтез является весьма сложной задачей с точки зрения эффективности времени и воспроизводимости с недолговечной радионуклид углерода-11 предлагает период полураспада 20 мин6. Общее время синтеза должно быть сведено к минимуму, и, как правило, не должно превышать 2-3 период ыполудения (т.е. около 40-60 мин для углерода-11)7. Особенно, процедуры синтеза для радиотрейсеров ориентации рецепторных систем с низкой плотностью экспрессии должны быть широко оптимизированы для получения достаточной урожайности и, следовательно, высокой молярной активности8. Синтетическая стратегия часто следует за продукцией радионуклида внутри циклотрон и отпускомNo 11C’CO2 к синтезатору. Там,No 11C’CO2 сначала сводится к11C CH 4, а затем отреагировал ийодом, чтобы дать11C’CH3Я с помощью газофазного метода9,10. Дальнейшая обработка серебряным трифлом дает11C’CH3OTf непосредственно в режиме он-лайн. После этого реактивный углерод-11 помечены промежуточные вводится в раствор, содержащий молекулы-предшественника. Автоматизированный радиосинтез дополнительно включает в себя процесс очистки с полу-подготовкой RP-HPLC, включая последующую разработку продукта, пригодного для доклинических и клинических исследований.
Независимо от период полураспада радионуклида и времени усилия радиосинтеза, фармакокинетическая радиофармацевтической является наиболее важной частью для оценки во время развития ПЭТ-трассировки. С точки зрения нейровизуализации, ввод мозга ПЭТ-трекер является основным условием. Тем не менее, гематоэнцефалический барьер (BBB), “граница безопасности” мозга, высоко выражает efflux транспортеров, которые могут выгрузить небольшие молекулы (например, ПЭТ-трассы) и эффективно препятствовать их применимости.
Огромным недостатком во время доклинической оценки являются неожиданные взаимодействия с этими транспортерами efflux, которые часто не распознаются вэкспериментах in vitro и приводят к сбою ПЭТ-трасса in vivo, как это наблюдается в 11 C’SNAP-7941. Изображение ПЕТ у крыс продемонстрировало низкое накопление мозга, которое резко возросло после введения ингибитора P-gp tariquidar11. Эти данные свидетельствуют о том, чтоNo 11C’SNAP-7941 является субстратом этой системы транспортера efflux, препятствующей связыванию лиганда к центральному MCHR1. К сожалению, по-прежнему отсутствует адекватные модели in vitro, позволяющие прогнозировать проникновение BBB на ранней стадии развития трассировщика.
Здесь мы описываем автоматизированный синтезNo 11C’SNAP-7941 с использованием синтезатора для метилирования углерода-11. Основное внимание в этой работе, чтобы дать обзор о том, как организовать последовательный экспериментальный подход, включая автоматизированный синтез, контроль качества, а также последовательные в пробирке оценки с очень недолго нуклид углерода-11.
Во-первых, описаны ключевые шаги для успешного радиосинтеза с минимальными затратами времени и максимаальной урожайностью. Затем, надежная процедура контроля качества устанавливается сделать радиотрейстер доступны для потенциальных клинических исследований и отвечают критериям Европейской Pharmacopoeia12. Количественная оценка концентрации моляров и расчет соответствующей молярной активности является необходимым требованием для последовательных кинетических измерений.
Наконец, представлен новый и простой метод in vitro, оценивающий взаимодействие11C’SNAP-7941 с транспортером эффлюкса, P-gp (hMDR1). Предлагаемая кинетическая модель использует простое в обращении устройство, которое позволяет немедленную интерпретацию данных и требует минимальных усилий по культуре клеток13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Радиосинтез No11C’SNAP-7941 был создан на коммерческом модуле синтеза. Благодаря возможности полной автоматизации процедуры приготовления радиосинтез был надежно надежен, и были достигнуты улучшения в области радиационной защиты оператора. Подготовка синтезатора оказывает огромное влияние на качество радиотрактора, особенно с точки зрения молярной активности. Таким образом, необходимо постоянно работать в инертных условиях (например, атмосфера гелия) и промывка всех линий, расположенных до реакционного сосуда (целевая линия, производственный цикл И реакторnoNo11CCH3I (см. рисунок2).). Кроме того, нагревание соответствующих ловушек и печей перед началом синтеза для удаления влаги и атмосферного углерода выгодно повышает активность моляров. Особенно столбец AgOTf, пропитанный графитным углем, чрезвычайно чувствителен к влажности. Даже незначительные количества любого источника влаги нарушают преобразованиеNo 11C’CH3I в11C’CH3OTf. Перед началом синтеза ловушкаNo 11C’CO2 и ловушкаNo 11C’CH3I должны быть охлаждены до комнатной температуры снова, чтобы обеспечить последующее улавливание. Кроме того, рекомендуется растворить предшественник незадолго до начала синтеза и добавить основание непосредственно в раствор прекурсора.
Контроль качества радиочастот углерода-11 должен быть рационально разработан для непрерывного и быстрого рабочего процесса. Однако наиболее важными параметрами для исследований клеточной культуры являются радиохимическая чистота и моляровая активность для получения достоверных результатов. Правильная оценка молярной активности требует надежного аналитического метода HPLC, а кривая калибровки должна охватывать диапазон концентрации конечного продукта. Сложная часть для радиочастот заключается в достижении концентрации выше предела количественной оценки (ЛОЗ) за счет небольших количеств, которые производятся во время радиосинтеза. Таким образом, искусство заключается в том, чтобы найти баланс между высокой молярной деятельности, чтобы избежать насыщения рецепторов и достаточно высоких концентраций, чтобы все еще быть в состоянии количественно нерадиоактивного сигнала.
11С. SNAP-7941 был подтвержден как мощный субстрат человека P-gp транспортер, как не было обнаружено накопления в необработанных или транспортных средств лечения MDCKII-hMDR1 клеток из-за быстрого efflux. В отличие от этого, оба экспериментальных установки (MDCKII-WT или предварительно заблокированных клеток MDCKII-hMDR1) дали аналогичные результаты (накопление11C’SNAP-7941), поддерживая универсальность этого анализа in vitro. Клетки MDCKII-hMDR1 очень подходят для экспериментов LigandTracer из-за их стабильной трансфекции, быстрого роста и стойких против сдвига стресса, вызванного вращающейся клеточной культуры блюдо. Отсутствие поглощения11C’SNAP-7941 в мозге крыс и мышей может, таким образом, произойти, вызванные efflux через P-gp транспортер. Из-за трансфекции клеток собачьих почек с человеческим мультинаркотической резистентностью белка 1 (hMDR-1, P-gp), прогностического значения этого метода для связывания транспортера эффлюкса у человека высока, что благоприятно с точки зрения будущего клинического применения. Однако до сих пор избирательность по отношению к другим транспортеру эффлюкса не была проверена. Таким образом, другие линии клеток могут быть использованы, выражая различные видные транспортеры efflux как белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP) или многократное сопротивление белка-1 (MRP-1), для изучения взаимодействия с этими транспортерами. Метод по сравнению с классическим накоплением или транспортным анализом очень прост и дает сразу качественные результаты. Кроме того, самым большим преимуществом является то, что эта технология позволяет оценивать прямое взаимодействие ПЭТ-трекера и цели в режиме реального времени, в отличие от обычного эксперимента с использованием косвенной количественной оценки (в основном смещения). Кроме того, программное обеспечение радиоассава в реальном времени обеспечивает экспериментальную гибкость (например, коррекция распада нуклидов, измерение времени и позиций и т.д.) и, следовательно, высокую свободу для пользователей. С другой стороны, ограничения метода включают низкую пропускную стоимость образца, так как одновременно можно измерить только одну клеточную тарелку. Кроме того, следует принять во внимание ряд других технических и оперативных вопросов: описанная технология очень чувствительна к фоновой радиации; таким образом, источники излучения должны храниться на расстоянии, и следует уделять особое внимание фоновым измерениям до проведения эксперимента. Другой вопрос, касающийся экспериментов при более высоких температурах, чем комнатная температура, является нагревание наклонной поддержки: испарение среды клеточной культуры может повлиять на детектор. Вместо нагрева, все устройство предпочтительно помещается в инкубатор. Кроме того, метод ограничен линиями клеток приверженцев. Через вращение тарелки культуры клетки, сдвига чувствительных к стрессу клетки могут отделиться от блюда, что может привести к недействительным результатам.
Тем не менее, если экспериментатор обращает внимание на эти незначительные недостатки, метод дает быстрые и надежные результаты для анализа кинетического поведения доклинических ПЭТ-трассеров.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Австрийским научным фондом (FWF P26502-B24, М. Миттерхаузер). Мы благодарны за техническую поддержку Т. Зенца и А. Кркала. Кроме того, мы благодарим К. Паллича за подготовку Аготфа и Х. Шпрейцера за распространение предшественника.
Materials
| Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
| Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
| Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
| Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
| Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
| NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
| Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
| Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
| Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
| Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
| Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
| Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
| PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| [11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
| TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
| Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
| Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
| NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
| Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
| 430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
| Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
| Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
| g-spectrometer | g-spectrometer | ||
| Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
| Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
| Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
| HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
| inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| In vitro experiments | |||
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| (±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
| DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
| Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
| LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
| Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
| Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |
References
- Saito, Y., Maruyama, K. Identification of melanin-concentrating hormone receptor and its impact on drug discovery. Journal of Experimental Zoology. 305, 761-768 (2006).
- Philippe, C., et al. Preclinical in vitro & in vivo evaluation of [11C]SNAP-7941 – the first PET tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1. Nuclear Medicine and Biology. 40, 919-925 (2013).
- Philippe, C., et al. Radiosynthesis of [ 11C]SNAP-7941-the first PET-tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1 (MCHR1). Applied. Radiation and Isotopes. 70, 2287-2294 (2012).
- Philippe, C., et al. SNAPshots of the MCHR1 : a Comparison Between the PET-Tracers [ 18 F ] FE @ SNAP and [ 11 C ] SNAP-7941. Molecular Imaging Biology. , 1-12 (2018).
- Schirmer, E., et al. Syntheses of precursors and reference compounds of the melanin- concentrating hormone receptor 1 (MCHR1) Tracers [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP for positron emission tomography. Molecules. 18, 12119-12143 (2013).
- Miller, P. W., Long, N. J., Vilar, R., Gee, A. D. Synthese von 11C-, 18F-, 15O- und 13N-Radiotracern für die Positronenemissionstomographie. Angewandte Chemie. 120, 9136-9172 (2008).
- Pichler, V., et al. An overview on PET radiochemistry: part 1 – covalent labels – 18 F, 11 C, and 13 N. Journal of Nuclear Medicine. 59, 1350-1354 (2018).
- Pichler, V., et al. Molar activity – The keystone in 11C-radiochemistry: An explorative study using the gas phase method. Nuclear Medicine and Biology. 67, 21-26 (2018).
- Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied Radiation and Isotopes. 48, 153-157 (1997).
- Dahl, K., Halldin, C., Schou, M. New methodologies for the preparation of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals. Clinical and Translational Imaging. 5, 275-289 (2017).
- Raaphorst, R. M., et al. Radiopharmaceuticals for assessing ABC transporters at the blood-brain barrier. Clinical. Pharmacollogy & Therapeutics. 97, 362-371 (2015).
- Nics, L., et al. Speed matters to raise molar radioactivity: Fast HPLC shortens the quality control of C-11 PET-tracers. Nuclear Medicine and Biology. 57, 28-33 (2018).
- Zeilinger, M., et al. New approaches for the reliable in vitro assessment of binding affinity based on high-resolution real-time data acquisition of radioligand-receptor binding kinetics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Research). 7, 22 (2017).
