Otomatik sentez ve gerçek zamanlı kinetik değerlendirmesinin teknik yönü [¹¹C] SNAP-7941

DIKKAT: aşağıdaki protokolde, radyoaktivite işleme ve manipülasyon gerektiren birden fazla adım bulunmaktadır. Her adımın, enstitünün radyasyon güvenliği departmanı ve ilgili ulusal yasama organı ile anlaşmada olması önemlidir. ALARA (“makul derecede ulaşılabilen”) ilkesinin ardından yer alan operatörler için iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmanın en aza indirilmesi zorunludur. 1. zaman yönetimi ve deney planlaması Not: karbon-11 ‘ in kısa yarı ömrü, radyoaktivite kaybını en aza indirmek için doğru zaman yönetimi gerektirir (Şekil 1). İlgili herhangi bir kişinin sorumluluk alanını ve ilgili eylemin zaman noktasını bildiği önemlidir. [11C] SNAP-7941 gerçek zamanlı kinetik deneyinin ayarlanması için, düzgün bir süreç için yaklaşık dört kişi gereklidir. [11C] SNAP-7941 için bir yapımcı düzenleyin. Kalite kontrol operatörü belirtimi değerlendirme, kütle konsantrasyonu ve sentez başlangıç zamanı molar aktivitesinin hesaplanması gerçekleştirmek bildirin. Gerçek zamanlı kinetik deneyleri seyreltme hesaplaması için hazır tutun ve deneyi gerçekleştirme. Radyoaktivite ilgili zaman noktasında ilgili yere transfer için Runner talimat. 2. preklinik kullanım için [11C] SNAP-7941 otomatik sentezi Synthesizer hazırlanması (Şekil 2). Synthesizer, gerekli Teknik gazlar (helyum ve hidrojen) ve synthesizer kontrol yazılımı Tracerlabaçın. İlgili sentez sırası Snapseçin. Yıkama V1-V3 bir kez su ile ve iki kez aseton ile reaktör ve HPLC Vana ya yük veya döngü atık şişe içine pozisyon enjekte. Tüm ilişkili hatları içine ve dışına reaktör üzerinden kuru bir sürekli helyum akışı ile enjeksiyon vana ile V18 üzerinden aktive. Isı [11c] ch3ı Trap yanı sıra [11c] ch3otf Trap altında bir helyum akışı 100 ml · Min-1 kadar 200 °C üzerinden v24, v25, v29, v15, V9, v17 ve V32/V33 müstakil reaktör ile. 100 mL · min-1helyum akışına sahip sızıntı (bağlı reaktör ile) için aynı yolu kontrol edin. Akış 4 mL altında düştüğünde sıkışma garantisi · Min-1. HPLC pompasını açın (5-10 mL · min-1) ve HPLC hatlarını ve enjeksiyon vanasını Asetonitril/su (50/50, v/v) ile HPLC çözücüleri ile v14 yoluyla ampul içine yıkayın. V19 ve V12 üzerinden bir helyum akışı ile bir çöp şişesi içine ampul boş. Bir helyum akışına v18 ile v11 ve V12 üzerinden V6 ‘dan su ile ilgili hatları yıkayın. Wash v5 ile etanol ve v4 ile su ile v11 ve V12 ürün toplama şişesi IÇINE (PCV) ile bir helyum akışı kullanarak V18, sonra boş PCV üzerinden v13 ile çöp şişesi ile bir helyum akışı ile V20. HPLC pompasını kapatın, sentezi için çözücüye geçin ((sulu amonyum asetat (2,5 g · L-1)/asetik asit 97.5/2.5 v/v; pH 3.5)/acetonitrile 75/25 v/v), yarı Preparatif HPLC sütununa takın ve sütunu doğrultma (5 ml akış · Min-1). Sentezi ve arıtma için reaktifler doldurun: 1,5 mL su (v2), 4,5 mL 0,9% NaCl (v4), 0,5 mL% 96 etanol (V5), 10 mL su (V6), ve 90 mL su (ampul). Yeni bir döngü atık şişe takın; V13 ve sıvı nitrojen için bir ürün şişesi (etiketlenmiş ve havalandırma iğnesi ile donatılmıştır). Ön koşul bir SPE (katı faz ekstraksiyon) 10 mL% 96 etanol ve 20 mL su ile kartuş ve v11 ve V12 arasında takın. Sentezi başlatmadan önce, [11C] Co2 Trap ‘i 400 °c ‘ ye ısıtarak ve 50 ml ‘lik helyum akışıyla Trap ‘i yıkmadan önceki 20 dakika öncesi Çalıştırma sırasını başlatın · Min-1Via v27 (2 dak). Sonra, [11C] Co2 Trap ‘i 3 dakika boyunca hidrojen gazı (120 ml · Min-1) ve sonunda 40 °c ‘ ye kadar soğutmak için ön yıkama yapın. 400 μL Asetonitril (DNA sentezi için, < 10 H2O), reaksiyonda çözüm transferi ve 5,5 μL tbah (264 mg · ml-1 metanol içinde) ekleyin 1 mg habercisi çözülür. Reaktörü ilgili konumuna takın. Sıcak hücreyi kapatın ve sıcak hücrenin altında basıncı açın. CH4 tuzağı ile sıvı nitrojen-75 °c arası soğutma sürecinin başlamasını onaylayın. Sıcaklık ulaşıldığında radyoaktivite bırakın. [11C] Co2 cyclotron üretimiNot: adım 2.2.1-2.2.4 radyosentez modülünün hazırlanması için eşzamanlı olarak gerçekleştirilir (Ayrıca bkz. Şekil 1). Cyclotron mıknatıs açın. Hedef 11C-Co2 seçin ve Beam 65 μAbaşlatın. Düğmeye basarak ışınlama başlangıcımı onaylayın. Işını durdurun ve düğme teslimatınıiterek Sentezleyicinin içine radyoaktivite salınımı onaylayın, istenilen miktarda radyoaktivite ulaştıktan sonra (yaklaşık 120 gbq sonra 30 dakika). Tam otomatik radyosentezi yürütülmesi Sistem radyoaktivite almaya hazır olduğunu doğrulayın ve otomatik işlem başlatmak Aşağıdaki otomatik işlemi izleme. [11c] Co2 ‘ nin siklotron ‘dan, v26 (yaklaşık 4 dak) ile sentezi ünitesine otomatik olarak aktarılırsa ve [11c] Co2 ‘ nin bir katalizör olarak nikel ile emelenmiş moleküler elek üzerinde sıkışıp kaldıktan sonra kontrol edin ([ 11 ‘ i C] CO2 Trap) Oda sıcaklığında. [11C] Co2 Trap ilk olarak Helyum (50 ml · Min-1) ile ve daha sonra hidrojen gazı (120 ml · Min-1) ile otomatik olarak temizlendi. Daha sonra, v27 ve v25 kapalı olduğunu gözlemlemek ve sıkışmış [11c] Co2 hidrojen gazı dahil 400 °c ısıtılır ve oluşturulan [11c] ch4 daha önceden soğutmalı [11c] ch4 taşınır tuzak ve orada kapana kısılmış. V10 kapalı olduğunu monitör, v9 açıldı (iyot sütuna doğru) ve [11c] ch4 tekrar 80 °c [11c] ch4 tuzak ısıtarak serbest bırakılır ve aracılığıyla bir helyum akışı ile dolaşım birimine taşınan V10 (egzoz çıkışı). Ve [11 c]ch4 ‘ e dönüştürülürse daha fazla kontroledin [11 c] ch3ı sirkülasyon ünitesi içinde, hangi son yaklaşık 3 dakika ve biçimlendirilmiş [11c] ch3ı sürekli sıkışmış [11c] CH3ı tuzak. Bu Egzoz valfi V16 açıldığından emin olun ve [11C] ch3ı tuzak 90 ° c helyum akışı ile ısıtılır (20 ml · Min-1) ile v24. İşbu belgede olası yan ürünler kaldırılır ve V16 kapalıdır. [11C] ch3ı ‘nin reaktör içine Serbest bırakılmaya hazır olduğunu onaylayın. Aşağıdaki otomatik işlemi izleyin: [11c] ch3i tuzağı 190 °c ‘ ye ısıtılır ve biçimlendirilmiş [11c] ch 3 ı reaktöriçine [11c] ch3OTF Trap (V32 ve V33, hala 200 ° ‘ de serbest bırakılır) kontrol edin C), V7, ve V8 sürekli helyum akışı altında (10-25 mL · min-1, V24). Bu süreçte, v21 ve V23 (egzoz çıkışı) açık olması gerekir. Reaktördeki radyoaktivite miktarı artık yükselmiyor bir kez, radyasyon reaktör geldi onaylayın. Aşağıdaki otomatik işlemin izlenmesi ve gerekirse el ile müdahale için hazırlanıyor V23, v21 ve V8 otomatik olarak kapalı olup olmadığını kontrol edin ve reaksiyon karışımı 75 °C ‘ ye ısıtılır. 3 dakika sonra, reaktör sıvı nitrojen ile soğutulur Eğer sıcaklık 35 altında kadar dikkat °C. Daha sonra, reaksiyon karışımı v2 üzerinden 1,5 ml su ile sönme olduğundan emin olun. Bu süreçte, v21 ve V23 (egzoz çıkışı) açık olması gerekir. V21 ve V23 kapalı olup olmadığını takip edin ve reaksiyon karışımı HPLC döngü (5 mL) içine bir sıvı dedektörü geçerek HPLC enjeksiyon valfi aktarılır. Reaksiyon karışımı otomatik olarak HPLC sütununa enjekte edilirse takip edin. Kromatogram gözlemleyin ve düğme tepe başlangıcıile ürün zirvesinde manuel olarak keser. Yaklaşık 8-10 dk (akış: 5 mL · min-1, Şekil 3) bir bekletme süresi sonra ürün tepe sinyali neredeyse 400 CPS altında düştüğünde tepe sonuna basın. Ampul boşaltmayı hızlandırmak için ek bir helyum akışı açın. Ampul boşaltılır ve atık şişe gözlemlemek olup olmadığını izleyin: ampul v11 üzerinden boşaltılmış olup olmadığını kontrol edın, SPE Kartuşu ve V12 ile atık içine bir helyum akışı ile v19 ve ek bir helyum hattı ve ürün SPE kartuşu üzerinde korur. Ampul tamamen boş olduğunu onaylayın. SPE arıtma ve ürün transferinin otomatik sürecini izleme SPE kartuşunun V6, v11 ve V12 üzerinden 10 ml su ile yıkanmış olup olmadığını kontrol edin ve etanol, ürünü v5, v11 ve V12 üzerinden PCV ‘ye eller. Son olarak, Eğer 0,9% NaCl v4, v11 ve V12 aracılığıyla PCV içine ürün seyreltmeli eklenir dikkat edin. Ürün çözümünün v13 üzerinden transfer edildiğinden ve V20 üzerinden helyum akışına sahip son ürün şişesinin içine steril bir filtre olduğundan emin olun. Ürünün tamamen aktarıldığını onaylayın. 3. kalite kontrolü (QC) Not: radyoopharmaceuticals kalite kontrolü aşağıdaki parametreleri ölçmek içerir: Radyokimyasal saflık ve molar aktivitesi (RP-HPLC) Kalıntı çözücüler (gaz kromatografi, GC) Osmolality (buhar basıncı Osmometre) pH (pH-metre) γ spektrumlu/radiyonüklid saflık (γ Spektrometre) Yarı ömrü/radiyonüklid saflık (doz Kalibratörü) Tüm fiziko-kimyasal parametreler ürünün yayımlanmasından önce belirlenir ve değerlerin tanımlı kalite parametre aralığında olması gerekir. Kalite kontrol ekipmanlarının hazırlanması Hazırlık 30 dk önce sentez sonuna başlayın. Bir kurşun korumalı konteyner ve bağlı bir iğne ile korumalı 1 mL şırınga bir konik şişe hazırlayın. HPLC için suya ek-7941 (10 μg · mL-1) başvuru standardı çözümü hazırlayın. PH Ölçer, gaz kromatografi ve kullanılan gazlar, osmometresi ve HPLC ‘nin tüm bileşenlerini açın. HPLC kontrol yazılımını açın ve özel sütunu ve [11C] SNAP-7941 için ilgili yöntemi seçin (mobil faz: (su/asetik asit 97.5/2,5 v/v; 2,5 g. L-1 amonyum asetat; pH 3.5)/acetonitrile 70/30 v/v; akış: 1 ml · min -1) ve iki ölçüm (Standart ve ürün) ile örnek bir liste yazın. Sütunun şartlandırma yöntemini başlatın. 10 dk Klima sonra Hamilton şırınga ile SNAP-7941 referans çözeltisi 20 μL enjekte ve analiz çalıştırmak başlatın. Enjeksiyondan sonra Hamilton şırınga Asetonitril ve su ile iki kez yıkayın. GC denetim yazılımını başlatın ve örnek listesini yazın. Kalite kontrolü gerçekleştirme Sentez bittikten sonra ürünün mutlak radyoaktif verimi ölçmek ve ürün 100 μL transfer kalite kontrol için hazırlanan kurşun korumalı şırınga ile bir reaksiyon şişesi içine.Not: kalite kontrolden elde edilen tüm veriler ulusal yönetmeliklere uygun olarak belgelenmelidir. Analitik HPLC: radyokimyasal saflığı ve Kimyasal saflığı ölçün ve sonuçların hemen hücre kültürü deneyleri için sorumlu kişi bildirin. QC-Sample ‘ a 40 μL çizin ve HPLC ‘ye enjekte edilir. Enjeksiyon valfi kolunu yükten enjekte etmek için hareket ettirerek çalıştırın (Şekil 3).Not: çalışma sırasında (8 dak), protokolün diğer ölçümleri mümkün olduğunca fazla çürümeye önlemek için gerçekleştirilebilir. Kromatogram açın ve radyoaktivite kanalındaki tüm doruklarına entegre edin. Ürünün bekletme süresini (5.0-7.0 min) başvuru standardının bekletme süresi ile karşılaştırın. Eğrinin altındaki alanı, tüm tümleşik zirvelerin yüzde cinsinden karşılaştırın. Ürün zirvesinde toplam entegre alanların (radyo kanalı)% 95 ‘ den fazla (radyokimyasal saflık) olması gerekir. Kimyasal saflığı belirlemek için UV kanalındaki sinyali entegre edin. Ana saflık genellikle 2.8-3.5 dakikada habercisi Snap asit olduğunu. [NATC] SNAP-7941 konsantrasyonu, entegrasyon sonrasında kalibrasyon eğrisinden hesaplanır. Μmol · mL-1 ‘ te SNAP-7941 konsantrasyonunu hesaplayın ve aşağıdaki denklem vasıtasıyla molar aktivitesini belirleyin: Gaz kromatografi için, özel bir cam şişede 20 μL kalite kontrol örneğini aktarın. Otomatik Örnekleyici içine yerleştirin ve ölçümü başlatın. Ölçüm tamamlandıktan sonra kromatogram açın ve otomatik olarak entegre dorukların numaralarını yazın. Örnek daha fazla 410 ppm Asetonitril ve% 10 etanol içermemelidir. Osmolality: özel boş bir kağıt örnek disk koymak ve örnek 10 μL uygulayın. Osmolalite ölçümü için Kapat düğmesine basın. 3 dakika sonra, cihaz 190-500 mOsm aralığında olması gereken osmolalitesi görüntüler · kg-1. pH: elektrot su ile yıkayın. Numune elektrotunun koyarak pH ölçmek. PH 5.0-8.5 aralığında olmalıdır. Ölçümden sonra elektrotu tekrar yıkayın ve elektrodu referans pH çözümüne yerleştirin. γ-spektrum: QC numunesini γ spektrometrenin içine koyun, kontrol yazılımını açın ve ölçümü başlatın. Ölçümü durdurun ve 511 keV (Aralık 420-520 keV) olması gereken ölçülen enerjiyi yazın. Dosya menüsünü açın ve ilgili toplu iş numarası ile dosyayı güvenli. Adanmış yazılım kaydedilmiş spektrumunu geri çağırma ve spektrumunu yazdırın. Yarı ömrü: doz Kalibratörü kullanarak QC örneğinin etkinliğini iki kez ölçün. İlgili zamanları yazın ve üstel yarı ömrünü hesaplayın. Sürüm Tüm parametreler test edildikten sonra ve sonuçlar Avusturya makamlarının yönergelerine uygun olarak, radiotracer bırakın. İşleç verilerin doğruluğunu imzalamak zorunda. 4. P-GP taşıyıcıya yönelik etkileşimlerin değerlendirilmesi Hücre kültürü Çalışma masasının laminar hava akışını (LAF) başlatın ve çalışmaya başlamadan önce en az 15 dakika tezgahın temizliği yapın. Hücre kültürü ortamını, Otomatik Pipetleme yardımıyla steril Volumetrik pipet ile% 10 FCS (50 mL) ve% 0,5 antibiyotik (2,5 mL) ile LAF ‘da steril koşullarda karıştırın. MDCKıı-hMDR1 ve MDCKıı-WT hücrelerini çözün ve aseptik koşullar (LAF) altında yapılan deneylerin 10-14 gün öncesinde T75 veya T175 hücre kültüründe yetiştirin. Tüm yapışmaz ve apoptotik hücreleri kaldırmak için ertesi gün Orta değiştirin. Her üç günde bir orta taze bir ile değiştirin (12 mL için T75 ve 23 mL için T175 hücre kültürü Flask, sırasıyla). Hücreleri, yeni flsorlara veya hücre kültürü yemeklerine, deneylerin zaman zamanlamaya göre% 80 ‘ lik bir konfluence üzerine ayırarak, fosfolipid büyümesini önlemek için bölünür. Denemeler için hücre hazırlığı Bir hücre kültürü çanak bir eğik düzlemde 2 mL başına 2,5 x 105 hücre bir konsantrasyonda deneyler ve tohum iki gün önce Hücreleri Böl (Şekil 4). Hücreleri saymak ve uygun bölme oranını hesaplamak için otomatik bir hücre sayacı cihazı veya Neubauer sayım odası kullanın. Deneyler öncesi orta bir gün çıkarın, 4 mL DPBS ile kültür çanak üzerinde hücreleri yıkayın ve taze ekleyin 5 hücre kültürü orta mL. Tabağı yatay olarak kuluçte yerleştirin. Deneme öncesi en az 0,5 h DPBS ile hücreleri yıkayın ve 2 mL FBS ücretsiz orta ile değiştirin. Mikroskop ile konfluence ve hücre morfolojisi inceleyin. Üç farklı kurulumda deney yapmak. 4.2.3 ‘de açıklandığı gibi deneyler için Petri tabağı kullanın. 10 μM (±)-verapamil hidroklorür ile deneyler öncesinde 0,5 h için hücreleri tedavi edin. 0,98 eklemek μL verapamil stok solüsyonu (20,4 mM (±)-verapamil hidroklorür DMSO). Son DMSO içeriği% ≤ 0,05 tedavi sırasında. 0,5 h için hücreleri araç kontrolü (DMSO) ile kulyatın. İlaç tedavisi için kullanılan aynı hacmi kullanın. Gerçek zamanlı tahlil denemeleri (üç kurulumlar için) Cihazı, bilgisayarı açın ve doğru bağlandığından emin olun, ardından kontrol yazılımını açın. Bir hedef seçeneği seçin, şablonun kilidini açın ve aşağıdaki ayarı ayarlayın:Pozisyon sayısı: 2 (iki)Algılama süresi (sn): 3 (üç)Algılama gecikmesi süresi (ler): 2 (iki)İlk aşamanın adı: temel Hücre kutup alt tarafında ve hücre kültürü ortamı ile kaplı olduğundan emin olun, cihazın eğimli destek içine hücreye kültür çanak yerleştirin. Başlat düğmesi ile çalıştırmayı başlatın. Sistem dosyayı kaydetmek istiyor. Bir dosya adı ve bir kaydetme yolu seçin. Kontrol Merkezi açılır ve taban çizgisi ölçümü başlar (hücre kültürü çanak desteği dönmeye başlar). Diğer seçenekleraltında seçin:Zaman ölçeği: dakikaÇekirdeklide Düzeltme: Carbon-11 Grafikte eğrileri altındaki tüm kutuları işaretleyin (arka plan (kırmızı), hedef (mavi) ve hedef eksi arka plan (siyah)). Kalite kontrol parametrelerini edinin: molar aktivitesi [GBq. μmol-1] ve aktivite konsantrasyonu [MBq.ml-1] sentezi sonunda. 2 mL Test hacmine [NATC] SNAP-7941 15 Nm için ilgili izleyici hacmini hesaplayın. Pipeti ilgili hacmine ve [11C] SNAP-7941 ürününün bir kenar kalkanında bulunan bir bileşenine hazırlayın. Denetim Merkezi penceresinde Çalıştır ‘ı tıklatın. Yemek rotasyonu duruncaya kadar bekleyin ve başlık duraklatıldı ve sonraki aşamaile yan çubuk ortaya çıkar. Gerçek zamanlı kinetik cihazın kapağını açın. Kültür çanak destek 90 ° sola çevirin. Hesaplanan ses seviyesini ekleyin ve başlangıç konumuna geri dönün. Ardından cihazın kapağını kapatın. Denemeyi başlatmak için hemen devam düğmesine basın. Duraklama seçerek 20 dakika sonra deneyi sonlandırmak ve daha sonra çalıştırmak sonlandırmak (yan çubuğunda End Run tuşuna basın). İstatistik yazılımı kullanarak veri analizi ve işleme Gerçek zamanlı kontrol yazılımını açın. Gerekli kinetiği geri çağırmak için Açık dosyaları tıklayın. Kinetiği kontrol merkezi penceresinde gösterilmiştir. Doğrudan kinetik dışa aktarma eğrilerinesağ tıklayarak seçin. Ham verileri içeren metin dosyasını kaydedin. İstatistik programını açın ve gerçek zamanlı deneylerin ham veri dosyasını yapıştırın. Biyodağılımın ek olarak zaman (x ekseni) ile başlayın (arka plan ölçümü hariç) ve maksimum CPS (saniyede sayar) yüzde sinyali normalleştirmek. Tüm normalleştirilmiş verileri yeni bir GraphPad Prism dosyasına yükleyin. Ortalama değerleri ve standart sapma hesaplayın. Elde edilen verileri, üç ayarında bulunan Tracer alımı ‘nın sapma (artış oranı) gösteren grafik olarak gösterir.