Aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de [¹¹C] SNAP-7941

CAUTION: no seguinte protocolo são as etapas múltiplas envolvidas que exigem a manipulação e a manipulação da radioactividade. É importante que cada passo esteja de acordo com o departamento de segurança radiológica do Instituto e o respectivo legislador nacional. É obrigatório minimizar a exposição a radiações ionizantes para os operadores envolvidos na sequência do princípio ALARA (“tão baixo quanto razoavelmente alcançável”). 1. gerenciamento de tempo e planejamento do experimento Nota: a meia-vida curta do Carbon-11 requer um gerenciamento de tempo preciso para minimizar a perda de radioatividade (Figura 1). É importante que qualquer pessoa envolvida conheça a sua área de responsabilidade e o ponto temporal da respectiva acção. Para a set up de uma experiência cinética em tempo real de [11C] SNAP-7941, cerca de quatro pessoas são necessárias para um processo suave. Organize um produtor para [11C] SNAP-7941. Informar o operador de controle de qualidade realizando a avaliação da especificação, cálculo da concentração de massa e atividade molar do tempo de início da síntese. Segure o experimentador cinético em tempo real pronto para o cálculo da diluição e realizando o experimento. Instrua o corredor para transferir a radioatividade para o respectivo local no respectivo ponto de tempo. 2. síntese automatizada de [11C] SNAP-7941 para uso pré-clínico Preparação do sintetizador (Figura 2). Ligue o sintetizador, os gases técnicos necessários (hélio e hidrogênio) e o software de controle de sintetizador Tracerlab. Selecione a respectiva sequência de síntese snap. Lave v1-v3 uma vez com água e duas vezes com acetona através do reator e da válvula da HPLC ou na carga ou injete a posição no frasco waste do laço. Seque todas as linhas associadas dentro e fora do reator através da válvula da injeção com um fluxo contínuo do hélio ativado através de v18. Aqueça o [11c] ch3I armadilha, bem como o [11c] ch3OTF Trap um fluxo de hélio de 100 ml · min-1 até 200 ° c através de v24, v25, v29, v15, V9, v17 e V32/5/10 com reator destacado. Verifique o mesmo caminho para vazamentos (com reator anexado) com um fluxo de hélio de 100 mL · min-1. A tensão é garantida quando o fluxo cai abaixo de 4 mL · min-1. Gire sobre a bomba da HPLC (5-10 mL · min-1) e lave as linhas da HPLC e a válvula da injeção com acetonitrila/água (50/50, v/v) assim como as linhas da HPLC com o solvente da HPLC através de v14 no bulbo. Esvazie o bulbo via v11 e V12 no frasco de resíduos com um fluxo de hélio via v19. Lave as respectivas linhas com água de V6 novamente via v11 e V12 com um fluxo de hélio via v18. Lave V5 com etanol e V4 com água via v11 e V12 no frasco de coleta de produto (PCV) usando um fluxo de hélio via v18, em seguida, esvazie o PCV via v13 para o frasco de resíduos com um fluxo de hélio via V20. Desligue a bomba HPLC, mude para o solvente para a síntese ((acetato de amónio aquoso (2,5 g · L-1)/ácido acético 97,5/2.5 v/v; pH 3.5)/acetonitrila 75/25 v/v), fixe a coluna semipreparativa da HPLC e equililoque a coluna (fluxo de 5 mL · min-1). Preencha os reagentes para a síntese e purificação: 1,5 mL de água (v2), 4,5 mL de 0,9% NaCl (v4), 0,5 mL de 96% de etanol (V5), 10 mL de água (V6) e 90 mL de água (bulbo). Anexar um novo frasco de resíduos de loop; um frasco para injetáveis do produto (rotulado e equipado com uma agulha de aeração) para v13 e o azoto líquido. Pré-condicionar um cartucho de SPE (extração em fase sólida) com 10 mL de etanol a 96% e 20 mL de água e anexá-lo entre v11 e V12. Inicie a sequência de pré-funcionamento 20 min antes de iniciar a síntese, consistindo em aquecer a armadilha [11C] co2 para 400 ° c e nivelar a armadilha com um fluxo de hélio de 50 ml · min-1via V27 (2 min). Em seguida, pré-lave o [11C] co2 Trap por 3 min com gás hidrogênio (120 ml · min-1) e, finalmente, arrefecer abaixo de 40 ° c. Dissolver 1 mg de precursor em 400 μL de acetonitrila (para síntese de ADN, < 10 H2o), transferir a solução para a reacção e adicionar 5,5 ΜL de tbah (264 mg · ml-1 em metanol). Prenda o reator à sua respectiva posição. Feche a célula quente e ligue a pressão a célula quente. Confirme o início do processo de arrefecimento da armadilha CH4 com nitrogênio líquido a-75 ° c. Liberte a radioactividade quando a temperatura for atingida. Produção de ciclotron de [11C] co2Nota: as etapas 2.2.1-2.2.4 são conduzidas simultaneamente à preparação do módulo da radiosíntese (Veja também Figura 1). Ligue o ímã do ciclotron. Selecione o alvo 11C-Co2 e inicie o feixe 65 μA. Confirme o início da irradiação empurrando o botão iniciar a irradiação Pare o feixe e confirme a liberação da radioatividade no sintetizador empurrando o botão de entrega, após a quantidade desejada de radioatividade é atingido (aprox. 120 GBq após 30 min). Execução da radiosíntese totalmente automatizada Confirme se o sistema está pronto para receber a radioatividade e iniciar o processo automatizado Monitorando o seguinte processo automatizado. Verifique se o [11c] co2 é automaticamente transferido do ciclotron para a unidade de síntese através de V26 (aprox. 4 min) e que o [11c] co2 está preso na peneira molecular impregnada com níquel como um catalisador ([ 11 anos de C] CO2 armadilha) à temperatura ambiente. Acompanhe se o [11C] co2 Trap é automaticamente liberado primeiro com hélio (50 ml · min-1) e, em seguida, com gás hidrogênio (120 ml · min-1). Em seguida, observe que V27 e v25 estão fechados e os presos [11c] co2 , incluindo o gás hidrogênio é aquecido a 400 ° c e que o formado [11c] ch4 é mais transportado para o pré-arrefecido [11c] ch4 armadilha e presa lá. Monitor que V10 é fechado, V9 aberto (para a coluna de iodo) e [11c] ch4 é liberado outra vez aquecendo a armadilha de [11c] ch4 lentamente a 80 ° c e transportado na unidade da circulação com um córrego do hélio através V10 (saída de escape). E verifique se [11c] ch4 é convertido para [11c] ch3i dentro da unidade de circulação, que duram cerca de 3 min e o formado [11c] ch3I é continuamente preso no [11c] CH3I armadilha. Certifique-se de que a válvula de escape v16 está aberta e a armadilha [11C] ch3I é aquecida a 90 ° c com um fluxo de hélio (20 ml · min-1) via v24. Por este meio, os subprodutos possíveis são removidos e, em seguida, v16 é fechado. Confirme que o [11C] ch3I está pronto para ser liberado no reator. Monitore o seguinte processo automatizado: Verifique se o [11c] ch3i armadilha é aquecida a 190 ° c e o formado [11c] ch3i é liberado para o reator através do [11c] ch3OTF Trap (V32 e, ainda, em 200 ° C), v7 e V8 um fluxo contínuo de hélio (10-25 mL · min-1, v24). Durante este processo, v21 e v23 (saída de escape) tem que ser aberto. Confirme que a radioatividade chegou ao reator, uma vez que a quantidade de radioatividade no reator não está aumentando mais. Acompanhamento do processo automatizado a seguir e preparação para intervenção manual, se necessário Verifique se v23, v21 e V8 são automaticamente fechados e a mistura de reação é aquecida a 75 ° c. Após 3 min, observe se o reator é resfriado com nitrogênio líquido até que a temperatura esteja abaixo de 35 ° c. Posteriormente, certifique-se de que a mistura de reacção é extinto com 1,5 mL de água via v2. Durante este processo, v21 e v23 (saída de escape) tem que ser aberto. Acompanhe se v21 e v23 estão fechados e a mistura de reação é transferida para a válvula de injeção de HPLC, passando através de um detector de fluido para o loop HPLC (5 mL). Acompanhe se a mistura de reação é injetada automaticamente na coluna HPLC. Observe o cromatograma e corte manualmente o pico do produto através do início do picodo botão. Pressione a extremidade Peak quando o sinal de pico do produto cai abaixo de aproximadamente 400 CPS após um tempo de retenção de cerca de 8-10 min (fluxo: 5 ml · min-1, Figura 3). Ligue um fluxo de hélio adicional para acelerar o esvaziamento do bulbo. Monitore se o bulbo está esvaziando e observe o frasco waste: verific se o bulbo está esvaziado através de v11, o cartucho de SPE e V12 no desperdício com um córrego do hélio através de v19 e uma linha adicional do hélio e se o produto retém no cartucho de SPE. Confirme que a lâmpada está completamente vazia. Monitoramento do processo automatizado de purificação de SPE e transferência de produtos Verifique se o cartucho SPE é lavado com 10 mL de água via V6, v11 e V12 nos resíduos e se o etanol eluta o produto para o PCV via V5, v11 e V12. Finalmente, observe se 0,9% NaCl é adicionado ao PCV via v4, v11 e V12 para diluir o produto. Certifique-se de que a solução do produto é transferida via v13 e um filtro estéril para o frasco do produto final com um fluxo de hélio via V20. Confirme que o produto foi completamente transferido. 3. controle de qualidade (QC) Nota: o controlo de qualidade dos radiofármacos inclui a medição dos seguintes parâmetros: Pureza radioquímica e atividade molar (RP-HPLC) Solventes residuais (cromatografia gasosa, GC) Osmolaridade (Osmómetro de pressão de vapor) pH (medidor de pH) γ Spectrum/radionuclide pureza (γ-espectrômetro) Pureza de meia-vida/radionuclídeos (Calibrador de dose) Todos os parâmetros físico-químicos são determinados antes da liberação do produto e os valores devem estar na faixa de parâmetros de qualidade definida. Preparação do equipamento de controlo de qualidade Comece a preparação 30 min antes do final da síntese. Prepare um frasco cônico em um recipiente blindado de chumbo e uma seringa blindada de 1 mL com uma agulha acoplada. Prepare uma solução padrão de referência de SNAP-7941 (10 μg · mL-1) em água para HPLC. Gire sobre o medidor de pH, o cromatografo do gás e os gáses usados, o osmômetro e todos os componentes do HPLC. Ative o software de controle de HPLC e selecione a coluna dedicada e o respectivo método para [11C] SNAP-7941 (fase móvel: (água/ácido acético 97,5/2,5 v/v; 2,5 g. L-1 acetato de amônio; pH 3,5)/acetonitrila 70/30 v/v; vazão: 1 ml · min -1) e escreva uma lista de amostras com duas medições (padrão e produto). Inicie o método de condicionamento da coluna. Injete 20 μL da solução de referência SNAP-7941 com uma seringa de Hamilton após 10 min de condicionamento e inicie a análise. Lave a seringa de Hamilton duas vezes com acetonitrila e água após a injeção. Inicie o software de controle GC e escreva a lista de exemplo. Realizando controle de qualidade Meça o rendimento radioactivo absoluto do produto após o fim da síntese e transfira 100 μL do produto para um frasco de reacção com a seringa preparada com blindagem de chumbo para controlo de qualidade.Nota: todos os dados obtidos a partir do controlo de qualidade devem ser documentados de acordo com os regulamentos nacionais. HPLC analítica: Meça a pureza radioquímica e a pureza química e informe a pessoa responsável para as experiências da cultura da pilha imediatamente dos resultados. Extrair 40 μL da amostra de CQ e injetar na HPLC. Iniciar a corrida movendo o braço da válvula de injeção da carga para injetar (Figura 3).Nota: durante a corrida (8 min), outras medições do protocolo podem ser executadas para evitar o máximo de deterioração possível. Abra o cromatograma e integre todos os picos no canal de radioatividade. Compare o tempo de retenção do produto (5,0-7,0 min) com o tempo de retenção do padrão de referência. Compare a área a curva em percentagem de todos os picos integrados. O pico do produto deve ser superior a 95% (pureza radioquímica) das áreas integradas totais (canal de rádio). Integre o sinal no canal UV para determinar a pureza química. A impureza principal é geralmente o ácido SNAP do precursor em 2.8-3.5 min. A concentração de [NATC] SNAP-7941 é calculada a partir da curva de calibração após a integração. Calcule a concentração de SNAP-7941 em μmol · mL-1 e determine a atividade molar por meio da seguinte equação: Para cromatografia gasosa, transfira 20 μL da amostra de controlo de qualidade num frasco para injetáveis de vidro dedicado. Coloque-o no amostrador automático e inicie a medição. Depois que a medida é terminada, abra o cromatograma e anote os números de picos automaticamente integrados. A amostra não deve conter mais de 410 ppm de acetonitrila e 10% de etanol. Osmolaridade: Coloque um disco de amostra de papel na cavidade dedicada e aplique 10 μL da amostra. Pressione o botão fechar para medir a osmolaridade. Após 3 min, o dispositivo exibe a osmolaridade que deve estar em uma faixa de 190-500 mOsm · kg-1. pH: Lave o eletrodo com água. Meça o pH colocando o eletrodo na amostra. O pH tem que estar em uma escala de 5.0-8.5. Lave o eletrodo novamente após a medição e coloque o eletrodo na solução de pH de referência. γ-Spectrum: põr a amostra do QC no γ-espectrómetro, abra o software de controlo e comece a medida. Pare a medida e anote a energia medida que tem que ser 511 keV (escala 420-520 keV). Abra o menu arquivo e seguro o arquivo com o respectivo número de lote. Lembre-se do espectro salvo no software dedicado e imprima o espectro. Meia-vida: medir a atividade da amostra QC duas vezes usando o calibrador de dose. Anote os respectivos tempos e calcule a meia-vida do exponencial. Lançamento Depois de todos os parâmetros terem sido testados e os resultados estarem de acordo com as directrizes das autoridades austríacas, liberte o radiotracer. O operador tem de assinar a exatidão dos dados. 4. avaliação das interações para o transportador da GP-P Cultura de células Inicie o fluxo de ar laminar (LAF) da bancada e limpe o banco pelo menos 15 min antes de começar a trabalhar. Misture o meio de cultura celular em condições estéreis no LAF com 10% de FCS (50 mL) e 0,5% de antibióticos (2,5 mL) com uma pipeta volumétrica estéril usando um auxílio de pipetagem automatizado. Thaw MDCKII-hMDR1 e MDCKII-WT células e cultivar em um T75 ou T175 cultura celular balão 10-14 dias antes de experimentos condições assépticas (LAF). Mude o meio no dia seguinte para remover todas as células não aderentes e apoptóticas. Substitua a cada três dias o meio com um fresco (12 mL para o T75 e 23 mL para o balão da cultura da pilha T175, respectivamente). Divida as células de acordo com o cronograma de experimentos para frascos frescos ou para pratos de cultura de células em cima de uma confluência de 80% para evitar o crescimento de BICAMADA. Preparação de células para experimentos Dividir as células dois dias antes de experimentos e sementes em uma concentração de 2,5 x 105 células por 2 ml em um plano oblíquo de um prato de cultura celular (Figura 4). Use um dispositivo de contador automático da pilha ou uma câmara de contagem de Neubauer para contar as pilhas e para calcular a relação de rachadura apropriada. Remova o meio um dia antes das experiências, lave as pilhas no prato da cultura com 4 mL de DPBS e adicione 5 mL frescos do meio de cultura da pilha. Coloque o prato horizontalmente na incubadora. Lave as células com DPBS pelo menos 0,5 h antes dos experimentos e substitua por 2 mL de meio livre de FBS. Examine a confluência e a morfologia celular com um microscópio. Realizando os experimentos em três configurações diferentes. Use a placa de Petri para os experimentos, conforme descrito em 4.2.3. Trate as células para 0,5 h antes de experimentos com 10 μM (±)-cloridrato de Verapamil. Adicionar 0,98 μL de solução de Verapamil (20,4 mM (±)-cloridrato de Verapamil em DMSO). O conteúdo final do DMSO é ≤ 0, 5% durante o tratamento. Incubar as células para 0,5 h com o controle do veículo (DMSO). Use o mesmo volume utilizado para o tratamento medicamentoso. Experimentos do ensaio em tempo real (para todas as três configurações) Ligue o dispositivo, o computador e certifique-se de que estão correctamente ligados e, em seguida, abra o software de controlo. Escolha uma opção de destino , desbloqueie o modelo e ajuste a seguinte configuração:Número de posições: 2 (dois)Tempo de detecção (seg): 3 (três)Tempo (s) de atraso de detecção: 2 (dois)Nome da primeira fase: linha de base Introduza o prato da cultura da pilha no apoio inclinado do dispositivo, certificando-se de que o pólo da pilha está no lado inferior e coberto com o meio de cultura da pilha. Inicie a execução através do botão Iniciar . O sistema está pedindo para salvar o arquivo. Escolha um nome de arquivo e um caminho de salvamento. O centro de controle aparece e a medição de linha de base começa (o suporte de prato de cultura de célula começa a girar). Selecione em outras opções:Escala de tempo: minutosCorreção de nuclide: Carbon-11 Verifique todas as caixas curvas no gráfico (fundo (vermelho), alvo (azul) e alvo menos fundo (preto)). Obter parâmetros de controle de qualidade: atividade molar [GBq. μmol-1] e concentração de atividade [MBQ.ml-1] no final da síntese. Calcule o respectivo volume de traçador para 15 nM de [NATC] SNAP-7941 no volume de ensaio de 2 ml. Prepare a pipeta para o respectivo volume e uma alíquota do produto snap-7941 [11C] numa blindagem de chumbo. Clique em Pausar executar na janela do centro de controle. Aguarde até que a rotação do prato pare e a barra lateral com o título pausado e a próxima fase ocorra. Abra a tampa do dispositivo cinético em tempo real. Gire o suporte de prato de cultura 90 ° para a esquerda. Adicione o volume calculado do traçador e volte para a posição inicial. Em seguida, feche a tampa do dispositivo. Pressione imediatamente o botão continuar para iniciar o experimento. Termine o experimento após 20 min selecionando pausar e, subsequentemente, termine a execução (pressione end Run na barra lateral). Análise e processamento de dados utilizando um software estatístico Abra o software de controle em tempo real. Clique em abrir arquivos para recordar a cinética necessária. A cinética é ilustrada na janela do centro de controle. Escolha com o botão direito do mouse diretamente nas curvas de exportaçãocinética. Guarde o ficheiro de texto que contém os dados brutos. Abra o programa de estatísticas e cole o arquivo de dados brutos de experimentos em tempo real. Comece com o tempo (eixo x) na adição de radiotraçador (exclua a medida do fundo) e normalizar ao sinal de porcentagem do CPS máximo (contagens por o segundo). Carregue todos os dados normalizados em um novo arquivo do GraphPad Prism. Calcule os valores médios e o desvio padrão. Ilustrar os dados obtidos como gráfico mostrando o desvio (taxa de aumento) de captação de traçador de todos os três set-ups.