הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

1. תרבות התא ביום 1 הערה: כל דוגמה עבור מיצוי המטולייט צריכה להיות מוכנה ממנה אחת של 100 מ”מ בלבד מרקמת רקמה בינוני, אך לא באופן מלא (המכיל כ-2 – 5 מיליון תאים). חשב את מספר המנות הדרושות לצורך הביצוע והכינו אותם בהתאם. תרבות HCC827 ותאים PC-9 ב 5% CO2 ב 37 ° c ב RPMI-1640 בינונית בתוספת עם 10% סרום העובר (fbs). ממנה את מדיית התרבות הסלולרית. ממנות התרבות 100 מ”מ רוחצים את התאים על כל מנה בעזרת 2 מ ל של תמיסת מלח מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום. הסלע בעדינות כל מנה כך הפתרון PBS לחלוטין מכסה את פני השטח של המנה. . מכבסת התרבות חם 0.25% טריפסין-EDTA הפתרון ל 37 ° c ולהוסיף 2 מ ל של טריפסין-EDTA פתרון עם הצנרת 5 מ ל בתוספת. מטלטל בעדינות כל מנה כך שהטריפסין מכסה לחלוטין את פני השטח של המנה. מודקון את מנות התרבות ב 37 ° c עבור כ 5 דקות. הוסף 4 מ ל של בינוני מראש מחומם לחלוטין הצמיחה לכל מנה. השהה מחדש את התאים במדיום על-ידי ליטוף מספר פעמים בעדינות. העבר כל השעיה התא לתוך שפופרת 1-mL ו צנטריפוגה נפרדת ב 800 × g עבור 5 דקות. השהה מחדש את כל הגלולה ב 2 מ ל של מדיום צמיחה מראש מחומם לחלוטין. קבע את המספר הכולל ואת הכדאיות הכוללת של התאים באמצעות מונה התאים האוטומטי ו-0.4% טרי, פתרון כחול. מערבבים 10 μL של השעיה לתא ו 10 μL של 0.4% הפתרון הכחול. טען 10 μL של דגימה לתוך התא ספירת שקופית קאמרית באמצעות נימי הפעולה. הכנס את השקופית הקאמרית. לתוך מונה התאים האוטומטי האור המשודר מאיר אוטומטית והכלי מתמקד באופן אוטומטי על התא. לחץ על לחצן הלכידה כדי ללכוד את התמונה ולהציג את התוצאות. במידת הצורך, להוסיף בינוני גדילה נוסף כדי לקבל את הריכוז הרצוי התא. זרע כ 1 – 2.5 מיליון תאים לכל 100 מ”מ צלחת תרבות התא.הערה: ריכוזי מטבוליט נקבעים על-ידי ניתוח CE-MS יהיה מנורמל על בסיס מספר תאים קיימא. לצורך ספירת תאים, יש צורך להכין לפחות מנה אחת נוספת של תרבות הזריעה עבור כל קבוצה. מודיית את מנות התרבות ב 5% CO2 ב 37 ° c עבור 18 h. 2. הכנת ריאגנטים לדלל את הפתרון הפנימי המסחרי כולל L-מתיונין סולפון ו d-קמפור-10-sulfonic חומצה 1000-מקפלים במים באולטרטהורים.הערה: עבור פחות מ 80 דגימות, פשוט לערבב 50 μl של התקן הפנימי פתרון 1 ו 45 mL של מים אלקטרופורזה ב בקבוקון מנפח 50 mL, ואז להביא את הפתרון עד 50 ml עם מים באולטרטהורים. להכין מ0.05 g/mL פתרון ניטול במים באלקטרופורזה כמו מאגר לשטוף.הערה: עבור פחות מ 30 דגימות, פשוט לפזר 25 גרם של ניטול ב 500 mL של מים אלקטרופורזה. כ 15 מ ל של מאגר לשטוף נדרש לכל 100 mm מאכל התרבות, כך להכין נפח מספיק של שטיפת מאגר על פי מספר דגימות. 3. כביסה מראש יחידות מסנן צנטריפוגלי פיפטה 250 μL של מים באולטרסאונד לתוך גביע המסנן של כל יחידת מסנן צנטריפוגלי (ראה את הטבלה של חומרים).הערה: יש צורך בשתי יחידות סינון לכל מדגם. כיסוי יחידות מסנן הדוק צנטריפוגה ב 9,100 × g ב 4 ° צ’ עבור 5 דקות. בדוק את עוצמת הקול של כל פילטרט — אם פילטרט משמעותי צבר במהלך הספין הקצר הראשון, יחידת הסינון עלולה להיות פגומה. במקרה זה, מחק את יחידת הסינון והשתמש ביחידת סינון חדשה במקום זאת. סגור את העפעפיים של יחידות מסנן בחוזקה צנטריפוגה שוב ב 9,100 × g ב 4 ° c עבור 30 דקות. ודא שאין מים בעלי בדיקת אולטרה-טהורות באף אחת מכוסות הפילטר; להסיר את המים באולטרסאונד מסוננים בכל צינור אוסף עם פיפטה ולהשליך.הערה: אל תנסו להסיר מים שיורית בגביע מסנן עם פיפטה, כפי שהוא עלול לגרום נזק למסנן. החלף את כוסות הפילטר בצינורות האוספים שלהם.הערה: השתמש ביחידות הסינון הצנטריפוגלי בתוך שעה מאז שהמסננים עלולים להיפגע בעת ייבוש. 4. תרבות התא ביום 2 קחו את מנות התרבות ה100 מילימטר מהאינקובטור.הערה: משך תרבות התא המומלץ הוא 18 שעות. מנושף את מדיום התרבות התאית מכל אחד מכלי התרבות 100 מ”מ. הוסף 10 מ ל של מדיום תרבות התא הכולל ריכוזים מתאימים של תרכובות או תרופות לכל מנה, מטפל לא להפריע שכבת התא.הערה: למטרות הדגמה, הוספנו 10 μL של 250 mM diamide מומס PBS (הריכוז הסופי של 250 μM) בניסוי זה. מכשלה את מנות התרבות ב-37 ° c למשך 30 דקות בנוכחות diamide או PBS כפקד. מנושף את מדיום התרבות התאית מכל אחד מכלי התרבות 100 מ”מ. לשטוף את התאים על ידי הוספת בעדינות 2 מ ל של 5% ניטול פתרון לקצה של כל מנה, מטפלת לא להפריע את שכבת התא, ואז קצת להטות את הצלחת.הערה: PBS או פתרון מלוחים מפריעה לניתוח metabolomic מבוסס CE-MS ומשפיע לרעה על תוצאות המדידה, ובכך לא צריך לשמש ככביסה מאגר. מטפי את מאגר הכביסה מכל צלחת התרבות, ולאחר מכן לשטוף את התאים שוב על ידי הוספת בעדינות 10 מ ל של מאגר לשטוף לכל מנה והטיית מעט את הצלחת. מטפי לגמרי את מאגר הכביסה. מהקצה של כל מנה תרבותיתהערה: מרוב מאגר לשטוף ככל האפשר, תוך שימת לב לא למשוך את התאים. מננירול משיורי עלול להפריע לניתוח CE-MS; השאיפה של תאים תפחית את מספר התאים וכך תהפוך למקור של שגיאה בנורמליזציה של נתונים. 5. הפקת מטבוליטים מתאים מתורבתים הוסף 800 μL של 99.7% מתנול לכל מאכל תרבות. הסלע בעדינות כל צלחת התרבות הלוך ושוב כדי לכסות את כל המשטח. השאירו את הכלים בטמפרטורת. החדר במשך 30 ס מ לאט להוסיף 550 μL של הפתרון תקן פנימי מדולל לכל מנה על ידי המהול את קצה הפיפטה לתוך מתנול ובעדינות ללטף למעלה ולמטה מספר פעמים. הסלע בעדינות כל צלחת התרבות הלוך ושוב כדי לכסות את כל המשטח. השאירו את הכלים בטמפרטורת. החדר במשך 30 ס מ 6. אולטראפילטרציה של תמציות תאים העבר את הפתרון המחולצים מכל צלחת תרבות לצינור שפופרת מיקרו-1.5 mL נפרד. צנטריפוגה את הצינורות ב 2,300 × g ב 4 ° צ’ עבור 5 דקות. העבר 350 μL של כל סופרנטאנט לשתי יחידות סינון צנטריפוגליים לכל מדגם.הערה: מכל מאכל תרבות, סך של 700 μL של הפתרון שחולץ מועבר לשני צינורות מסנן (350 μL/tube). צנטריפוגה את צינורות הפילטר ב-9,100 × g בשעה 4 ° צלזיוס עבור כ-2 מעלות עד שאין שרידי נוזלים בכוסות הפילטר. הסר את כוסות הפילטר וסגור בחוזקה את העפעפיים של צינורות הגבייה. 7. התאיידות לדוגמא הכינו מאייד צנטריפוגלי-בדרך כלל, זה מורכב מאייד, מלכודת קרה ומשאבת ואקום. הניחו את צינורות הגבייה. במאייד הצנטריפוגליהערה: השאר את העפעפיים של הצינורות פתוחים. להתנדף את הפתרונות לדוגמה שחולצו בתנאי ואקום בטמפרטורת החדר.הערה: תצורות טיפוסיות עבור מספר סיבובים והלחץ הם 1,500 rpm ו 1,000 אבא, בהתאמה, וזה בדרך כלל לוקח כ 3 h כדי להתאדות לחלוטין את הדגימות. ודא כי לא נשאר נוזל בכל צינורות האוסף ולסגור את העפעפיים של הצינורות בחוזקה. אחסנו את צינורות הגבייה בטמפרטורה נמוכה במיוחד (ל80 ° c) עד לניתוח metabolomic. 8. אנליזה Metabolomic של לסה נ-MS השהה מחדש את פילטרט ב 50 μl של מים באולטרסאונד באופן מיידי לפני ניתוח CE-MS. בצע ניתוח CE-MS לפי שיטות שתוארו בעבר12,13 באמצעות מערכת אלקטרופורזה קפילר ומערכת זמן של טיסה ספקטרומטר מסה מצויד משאבת isocratic, ce-ms מתאם, ו-ce-ESI מרסס.הערה: ניתן לשלוט בשתי המערכות על ידי התוכנה של ספקי המערכת ומחוברים באמצעות סיליקה קפילר מותך (50 יקרומטר קוטר פנימי × 80 ס מ אורך כולל). כוונן מכשירים ומבחנות לדוגמה, הכן את הקפילר באמצעות קלטת קפילר, לחדש את נוזלי המעטפת ומאגרי האלקטרופורזה המתאימים, בהתאם למצב ניתוח של האניב או הקטיון ולאחר מכן החל מתח.הערה: מכשור ותנאים אנליטיים מתוארים בפרוטרוט במקומות אחרים12,13. פתח את התוכנה והכנת רשימת עבודה המכילה שיטות לרכישת נתונים ומידע לדוגמה. התחל בבדיקה ובדוק את הנתונים כגון עוצמת האות וצורת השיא של תקנים פנימיים ורזולוציית השיא של תרכובות סטנדרטיות אחרות. כוונן את התנאים האנליטיים במידת הצורך. הכנס את הפתרונות לדוגמה ב 50 mbar עבור 3 s ומתח של 30 kV.הערה: CE-MS התנהל גם במצב יון חיובי או שלילי. הגדר את הספקטרומטר כדי לסרוק את טווח המסה m/z 50-1000. מתח נימי הנימים הוגדר ב-4 kV; קצב הזרימה של גז חנקן (טמפרטורת חימום 300 ° c). במצב חיובי, המתח הפרגמנטור, מזרן ומתח ה75 של OCT הוגדרו ב-50 ו-125 V, בהתאמה. עבור מצב יון שלילי, מדריך הפרגמנטור, מזרן, והמתח של OCT RFV הוגדר ב 100, 50, ו 200 V, בהתאמה. . לנתח נתוני ספקטרום לחלץ את הפסגות מן הנתונים ספקטרלי מסה באמצעות תוכנה שילוב אוטומטי כדי להשיג מידע השיא כולל m/z, אזור השיא, ואת זמן ההגירה (MT).הערה: השיטה מתוארת בפירוט במקום אחר14. אל תכלול את פסגות האותות המתאימות לisotopomers, ליוני האוורור וליונים מוצרים אחרים של מטבוליטים ידועים. ביאור פסגות שנותרו עם מידע ממסד הנתונים HMT מטבוליט על פי ערכי m/z ו MTs. נרמל אזורים של הפסגות המוערת לרמות סטנדרטיות פנימיות ומספרי תאים לכל מדגם. הערכת הריכוז של כל מטבוליט בתאים מתורבתים (pmol/106 תאים) באמצעות עקומות סטנדרטיות מוכן לכל מטבוליט. השתמש בריכוזי מטבוליט הקוונט לניתוחים סטטיסטיים נוספים ופרשנויות ביולוגיות14.