Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, Drosophila melanogasterutilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo
Summary
Este protocolo describe un ensayo de fagocitosis in vivo en adultos de Drosophila melanogaster para cuantificar fagocito reconocimiento y liquidación de las infecciones microbianas.
Abstract
En todos los animales, inmunidad innata proporciona una defensa inmediata y robusta contra un amplio espectro de patógenos. Respuesta inmune humoral y celular son las ramas principales de la inmunidad innata, y muchos de los factores de regulación de estas respuestas están conservadas evolutivamente entre los invertebrados y mamíferos. Fagocitosis, el componente central de la inmunidad celular innata, es llevado a cabo por células de sangre especializadas del sistema inmune. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha emergido como un poderoso modelo genético para investigar los mecanismos moleculares y efectos fisiológicos de la fagocitosis en animales enteros. Aquí demostramos un ensayo de fagocitosis in vivo basado en la inyección para cuantificar la absorción de partículas y la destrucción de las células sanguíneas de la Drosophila , hemocitos. El procedimiento permite a los investigadores controlar con precisión la concentración de partículas y la dosis, lo que permite obtener resultados altamente reproducibles en un corto período de tiempo. El experimento es cuantitativo, fácil de realizar y se puede aplicar a la pantalla para los factores del huésped que reconocimiento de patógeno de influencia, la absorción y separación.
Introduction
Defensas inmunes innatas forman la primera línea de defensa contra los microbios patógenos. Estas respuestas pueden dividirse funcionalmente en la inmunidad innata humoral y celular, los cuales son mediados por receptores de reconocimiento de patrón codificado del germline (PRRs) que sensación patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs)1. Muchas de las vías de señalización y mecanismos efectores de la inmunidad innata se conservan en mamíferos e invertebrados, tales como el nematodo Caenorhabditis elegans y la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster2. La mosca de la fruta se ha convertido en un potente sistema de defensa del huésped contra microorganismos infecciosos3de estudio. Drosophila es genéticamente manejable, fácilmente y a bajo costo criados en laboratorios y tiene un tiempo de generación corto. Además, la mosca de la fruta presenta eficientes defensas contra una amplia gama de microbios, lo que permite el examen de la inmunidad del anfitrión contra patógeno viral, bacteriana, micótica o parasitaria.
Inmunólogos de Drosophila han utilizado históricamente adelantadas pantallas genéticas, genoma mediada por RNA de interferencia (ARNi) proyección de líneas celulares de insectos y existían cepas de mosca mutantes para examinar la inmunidad innata – llevando a la identificación y caracterización de varias vías inmune humoral evolutivamente conservado4,5,6,7,8. La respuesta inmune innata humoral es, sin duda, el mejor caracterizado de defensa inmune en moscas de la fruta. Después de la infección, la respuesta humoral conduce a la producción y la liberación sistémica de péptidos antimicrobianos moléculas (AMP) en la hemolinfa, la sangre equivalente en insectos. Amperios se producen por peaje altamente conservado y vías de señalización del Imd. La vía de peaje es homólogo de mamíferos receptores TLR/IL-1R de señalización, y el camino de Imd es homólogo de mamífero Tumor necrosis factor-alpha señalización. En Drosophila, peaje señalización es inducida por bacterias Gram positivas, hongos y Drosophila X virus6,9,10 y señalización del Imd es inducida por bacterias Gram-negativas11 ,12.
Inmunidad celular, compuesto de encapsulado, melanization y fagocitosis de patógenos invasivos, llevado a cabo por células especializadas de sangre llamadas hemocitos13. Hay tres clases de hemocitos en la mosca de la fruta: cristal células, lamellocytes y plasmatocitos13. Las células de cristal, que constituyen el 5% de las circulación hemocitos de larvas, liberan enzimas proPhenoloxidase (proPO) conduce a la melanization de agentes patógenos y tejidos de host en sitios de la herida. Lamellocytes, que no se encuentran normalmente en embriones sanos o las larvas, son células adherentes que encapsulan objetos extraños. Estas células son inducidas a pupariación o parasitando huevos de avispa se depositan en las larvas. Plasmatocitos fagocitarias, que constituyen el 95% de circulación hemocitos de larvas y hemocitos restantes todos en adultos, juegan un papel en la remodelación durante el desarrollo de tejido y, en particular, como la célula efectora principal de la inmunidad celular de Drosophila .
Fagocitosis de una inmediata y crucial línea de defensa inmune innata; microbios que romper la barrera epitelial del huésped son envolvió rápidamente y eliminados por las células fagocíticas de la sangre (para un examen global de biología celular de la fagocitosis ver referencia 14). Este proceso se inicia cuando el reconocimiento de patrones codificados del germline receptores (PRRs) en hemocitos reconocen patógeno asociado patrones moleculares (PMAP) de microbios. Una vez enlazado a sus objetivos, PRRs inician cascadas de señales que conducen a la formación de pseudópodos a través de la remodelación del citoesqueleto de actina. Los pseudópodos rodean el microbio, que posteriormente se hundió e interiorizado en un orgánulo naciente, el fagosoma. Microbios se destruyen como el fagosoma somete el proceso de maduración del fagosoma cuando el fagosoma es traficada hacia el interior de la hemocyte y acidifica a través de una serie de interacciones con lisosomas. En vitro y célula biología estudios en mamíferos células primarias han sido instrumentales en la identificación y caracterización de factores que regulan la fagocitosis, como los mamíferos receptor Fc gamma y receptores de C3b15,16. Sin embargo, se limita la capacidad para ejecutar grandes pantallas o en estudios in vivo en sistemas mamíferos.
Aquí presentamos un ensayo in vivo para la fagocitosis en moscas de la fruta adultas, que se basa en un procedimiento introducido por primera vez por el laboratorio de David Schneider en 200017. El laboratorio de Schneider demostró que los hemocitos sésiles agrupadas a lo largo de la nave dorsal abdominal fácilmente fagocitar bacterias y granos del poliestireno. Para visualizar la fagocitosis, moscas se inyectan con fluorescencia etiquetadas partículas (tales como e. coli marcados con isotiocianato de fluoresceína (e. coli –FITC)), se incubó por 30 minutos para dar tiempo de hemocitos a fagocitar las partículas y luego inyectado con trypan azul, que apaga la fluorescencia de las partículas no fagocitados durante el período de incubación. Los vasos dorsales mosca entonces son reflejados usando un microscopio fluorescente invertido. Este trabajo seminal, usando un experimento relativamente sencillo, demostrado que los hemocitos fagocitar bacterias y gotas de látex, fagocitosis bacteriana pueden ser inhibidas mediante la pre-inyección de vuela con gotas de látex, y que vuela sin celular y humoral las respuestas inmunes son susceptibles a e. coli. El análisis presentado en este informe se basa en el trabajo del laboratorio de Schneider para cuantificar la fagocitosis in vivo mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de las partículas por hemocitos de vaso dorsal asociada.
Similar a los planteamientos en sistemas mamíferos, Drosophila genetistas utilizan inicialmente genoma pantallas de ARNi en vitro para identificar los genes necesarios para la respuesta inmune celular18,19,20 ,21,22,23. Sin embargo, el desarrollo del ensayo de fagocitosis in vivo adultos permitieron experimentos seguimiento fácilmente realizarse en animales enteros, así permitiendo a los investigadores a verificar los biológicos el papel de los factores identificados en los estudios in vitro. Tal fue el caso con el receptor transmembrana Eater, que fue primero identificado como un receptor bacteriano en una pantalla de RNAi usando S2 células24 y entonces más adelante demostrado para mediar la Escherichia coli (e. coli), Enterococcus faecalis, y fagocitosis de Staphylococcus aureus (S. aureus) en adultos25.
Nuestro laboratorio emplea el ensayo de fagocitosis in vivo en adelantados pantallas genéticas y estudios de Asociación de genoma completo (mediante el Panel de referencia genética de Drosophila (DGRP)) para identificar nuevos genes que regulan la fagocitosis en hemocitos de adultos. Estos estudios condujeron a la caracterización de los receptores PGRP-SC1A y PGRP-SA26, la vesícula intracelular trata de proteína Rab1427, el glutamato transportador Polifemo28, proteína de unión a RNA de Fox-129.
Esperamos que futuras pantallas incorporando la fagocitosis in vivo podrían conducir a la identificación de genes adicionales que son importantes para la inmunorespuesta celular en Drosophila. Pantallas con líneas endogámicas secuenciado completamente, como la DGRP o el recurso Drosophila de población sintética (DSPR), pueden identificar variantes naturales que afecta al desarrollo de la fagocitosis o hemocyte. Además, la técnica podría adoptada en otras especies de Drosophila o utiliza recursos de comunidad nueva pantalla, como la colección de 250 especies de Drosophila mantenida por la nacional Drosophila especie Stock Center (NDSSC ) en Cornell. Estos experimentos pueden llevarse a cabo utilizando marcada con fluorescencia bacteriano o fungicida pared biopartículas que están disponibles comercialmente o se pueden realizar usando cualquier número de especies bacterianas o por hongos – siempre que el microbio expresa marcadores fluorescentes .
Protocol
Representative Results
Discussion
Comercialmente disponibles, fluorescencia etiquetadas partículas se utilizan para evaluar fagocitosis en general (0,2 μm modificado carboxylate microesferas) o fagocitosis de microbios (marcada con fluorescencia calor o químicamente mató las bacterias o levaduras). Para evaluar la maduración del fagosoma, los investigadores pueden seleccionar partículas con un tinte pH-sensible que fluoresce cuando pH de neutro a ácido, como en el fagolisosoma. Alternativamente, para examinar los pasos iniciales de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el Dr. Beth González y Dr. Aprajita Garg para apoyo en la realización de los experimentos de fagocitosis in vivo. Una subvención de NSF UMD avance semilla y UMD NIH T32 becas de formación, célula y Biología Molecular (CMB) y las interacciones huésped-patógeno (HPI), financiado por este trabajo.
Materials
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
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