細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出

1. BACにおけるZIKV感染性cDNAクローンの構築 注:BACにおけるZIKVの組み立て戦略について、RGN株13(加盟番号KU527068)について説明する(図2)。 プラスミドpBeloBAC11に存在しないウイルスゲノムに適切に間隔をあけた固有の制限部位を選択する(図2A)。注:ZIKV-RGNでは、制限部位Pml I、Afe I、およびBstB I(ゲノム位置3,347、5,969、および9,127)がそれぞれ選択された。ウイルスゲノムに適切な制限部位が利用できない場合には、cDNA断片設計中にウイルスゲノムに無声ヌクレオチド変異を導入して新たな制限部位を生成する。 全長ゲノム(Z1〜Z4)にまたがる4つのcDNA断片を化学合成により生成し、5’末端およびHDV RZのCMVプロモーターによって側面付けされ、BGH終端、およびポリアデニル化配列を3′-end(図2B)で生成する。各フラグメントは、選択した制限サイトによって横たわっている必要があります (ステップ 1.1)。注:フラグメント Z1 は、pBeloBac11 内の残りのフラグメントを複製するためのバックボーンとして使用されます。そのためには、ヒトCMVプロモーターを含む必要があり、ApaL I(pBeloBAC11でこの断片をクローンする)とAsc I(ウイルスゲノムに存在しない)によって5′-終端に横たわっていなければならない。.、Afe I、および BstB I)に続いて、Mlu I(ウイルスゲノムに存在しない)およびBamH I(pBeloBAC11でこの断片をクローンする)が続く。フラグメントZ4は、選択された最後の制限部位(BstB I)からウイルスゲノムの末端までのゲノム領域を含み、続いてHDV RZ、BGH終端、およびポリアデニル化配列、およびMlu I制限部位(図2B)を含む必要があります。あるいは、cDNA断片(Z1-Z4)は、標準的な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)と、特定のオリゴヌクレオチドを用いた重複するPcRの組み合わせによって生成され得る。 断片Z1からZ4の逐次クローニングにより感染性cDNAクローンをpBeloBAC11(図2B)に組み立てる。 pBeloBAC11プラスミドとZ1フラグメントをApaL IおよびBamH Iで消化する。そのために、pBeloBAC11プラスミドの2μgまたはZ1フラグメントの1μgを10μLの10μLの反応バッファー、各酵素の20単位、および水を混合して、100 μLの最終体積に達する。 エビアルカリホスファターゼ(SAP)を用いてBACベクターを脱リン酸化する。そのために、消化されたBACに2.5 μL(2.5単位)のSAPを加え、37°Cで1時間37°Cでインキュベートし、75°Cで15分間インキュベーションしてSAPを熱活性化させます。 10kbを超えるDNA断片の精製に最適化された市販のゲルクリーンアップキットを用いて、アガロースゲル電気泳動による脱リン酸化BACベクターおよびフラグメントZ1を精製する(材料の表を参照)。 ライゲーション反応を行い、プラスミド(p)BAC-Z1を生成する。そのために、150ngの精製消化BACベクターを精製インサートと1:3のモル比を用いて精製インサートと混合し、10mM ATPを含む10x T4 DNAリゲスバッファーの1.5 μL、T4 DNAリゲスの1単位、および水を15μLの最終容積に混合する。 ライゲーション混合物を16°Cで20時間インキュベートします。ライゲーション反応の制御として、挿入せずにライゲーション反応を並列に行う。65°Cでインキュベーションにより15分間リゲスを熱不活性化する。注:鈍い終わりのDNの場合は、14°Cで20hのライゲーション反応をインキュベートする。BACベクター(図2A)の大きさに起因して、ライゲーション効率を高めるためには、従来のプラスミドを用いてライゲーションよりも多量のベクターとインサートを使用することが不可欠です。 エレクトロポレーション(25 μF容量、2.5 kV、および100 Ω抵抗)によるライゲーション反応の2μL(ステップ1.3.5)を有する大腸菌DH10B電気容量細胞の50μLを変換し、0.2の間隔で間隔をあけた電極を装着した電極キュベットを使用して標準プロトコルに従います。 1 mLのSOC培地(2%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.05%NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl 2、10mMMgSO 4、20mM[pH 7.0])で細胞を37°Cでインキュベートし、10°C(20°C)でインキュベートします(20)。12.5 μg/mLクロラムフェニコールを含むルリアブロス(LB)寒天プレートに細胞をプレートし、16時間37°Cでインキュベートします。 8~12個の細菌コロニーを選び、12.5μg/mLクロラムフェニコールを含む新鮮なLB寒天プレートにレプリカを作成し、特定のオリゴヌクレオチドを用いた直接PCR分析により正しい挿入物が含まれているかどうかをテストします。 レプリカプレートから正のコロニーを選び、クロラムフェニコールの12.5μg/mLを含むLBの100mLで成長させ、市販のプラスミドミディキットを用いたアルカリ性リシス法によりBAC cDNAを単離し、大型の精製の推奨に従って低コピープラスミド(材料の表を参照)。注:この方法で調製したBAC cDNAは、細菌ゲノムDNAの最大30%で汚染することができますが、制限分析、シーケンシング、クローニングを行うには品質に適しています。BACサイズに応じて、BACプラスミドの4〜6μgの収率が得られる。 制限分析により、クローンcDNAの遺伝的完全性を確認します。1時間37°CでAsc I及びPml Iを用いてpBAC-Z1プラスミドの500ngを消化し、ゲル電気泳動によるZ1断片の存在を確認した。望ましくない突然変異が導入されていないことをさらに確認するには、特定のオリゴヌクレオチドで挿入物を配列する。 選択された制限部位(Pml I、Afe I、BstB I、およびMlu I)を含むプラスミドpBAC-Z1から始まり、順次フラグメントZ2からZ4にクローンを作成し、全長感染性cDNAクローンpBAC-ZIKV(図2B)を生成し、同様の実験を行った。フラグメント Z1 (手順 1.3.1-1.3.10) に対して上記のようにアプローチします。 2. 感染性rZIKVの救助のための高純度pBAC-ZIKVの準備 注:感染性ウイルスのトランスフェクションおよび救助に適した超純型pBAC-ZIKV感染クローンの大規模な調製は、BAC精製のために特別に開発された市販キットを用いてアルカリ性リシスによって行われる(表参照) 材料)。キットには、細菌ゲノムDNA汚染を除去するATP依存性エキソヌクレアーゼ消化ステップが含まれている必要があり、塩化セシウム法で得られたものと同様の純度の高いBAC cDNAの単離を可能にする。 pBAC-ZIKV感染性クローンを5mLのLB培地に含む大腸菌DH10Bの単一コロニーを37°Cで37°C(200-250rpm)で8時間成長させる。 2Lフラスコに12.5 μg/mLのクロラムフェニコールを含むLBの500 mLに細菌培養の1 mL(ステップ2.1)を加え、14-16h(0.6-0.8のOD600まで)37°Cで細胞を増殖させる。注:素晴らしいスープ(TB)のような豊富なスープは、非常に高い細胞密度を生成することができ、その結果、BAC cDNAの収率が低く、純度が低くなります。 BAC感染性cDNAクローンを、メーカーの仕様に従って、BAC精製用に特別に開発された市販キットを使用してアルカリリシスで精製します(材料の表を参照)。精製されたBAC cDNAを4°Cに保ちます。BACサイズに応じて、30μgの超純酸BAC cDNAクローンの収率を得ることができます。注:過度の乾燥はBAC cDNAを溶解することが困難になるので、5分以上DNAペレットを乾燥させないようにしてください。BAC cDNAクローンのサイズが大きいため、プラスミド剪断を防ぐために渦やピペッティングを避けてください。 3. ベロ細胞のトランスフェクションによるBAC cDNAクローンからの感染性rZIKVの救出 注:感染性rZIKVは、市販のカチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いて、pBAC-ZIKV cDNAクローンを用いたベロ細胞のトランスフェクションによって回収される(材料の表を参照)図3) トランスフェクションの前日、6ウェルプレート5 x 105ベロ細胞/成長培地(ダルベッコの改変イーグル培地[DMEM]は5%の胎児ウシ血清[FBS]、2mM L-グルタミン、1%非必須アミノ酸)を抗生物質なしで補充した。トランスフェクション時までに90%のコンフルエント細胞単層を上げる。注:ウイルス救助を三循環で行うことをお勧めします。 室温で血清還元培地(材料表参照)を平衡化し、トランスフェクションサンプル毎に無菌マイクロフュージチューブ内のトランスフェクション混合物を以下のように調製する。 血清還元培地の250μLにBAC cDNAクローンの4 μgを加え、慎重に混ぜ合わせ、プラスミド剪断を防ぐために渦を避けます。 別のチューブでは、12μLのトランスフェクション試薬(1mg/mL)を血清還元培地の250μLで希釈し、渦で混合し、室温で5分間インキュベートする。 希釈されたBAC cDNAとトランスフェクション試薬(DNA:トランスフェクション試薬の1:3比)を組み合わせ、渦を避けながら慎重に混合し、室温で20〜30分間インキュベートします。 BAC cDNA/トランスフェクション試薬混合物のインキュベーション期間中、抗生物質なしで成長培地でベロ細胞を洗浄し、抗生物質なしで新鮮な培地の1 mLで細胞を残します。注:トランスフェクションプロセス中の抗生物質の添加は、トランスフェクション効率を低下させる可能性がある。 BAC cDNA/トランスフェクション試薬混合物(ステップ3.2.3)の500 μLをVero細胞に滴下し、プレートを前後に揺さぶって混合し、5%CO2加湿インキュベーターで細胞を6時間37°Cでインキュベートします。 トランスフェクション培地を取り除き、抗生物質(100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)で2mLの新鮮な成長培地を追加し、37°Cで5%CO2加湿インキュベーターで細胞をインキュベートし、サイトパシー効果の誘導を毎日チェックします(CPE)).注:ZIKV CPEはVero細胞で非常に顕著であり、組織培養上清に剥離して浮遊する丸みを帯びたビレフジエント細胞の存在によって特徴付げられる。 24時間ごとにベロ細胞組織培養上清(ステップ3.5)のアリコート(100μL)を収集し、新鮮なベロ細胞上の標準的なプラークアッセイを用いてZIKVの存在を評価してウイルス回収の効率を決定する(図4A)。 トランスフェクションの4〜6日後、CPEが約50%〜75%(図4B)である場合、15mL円錐管および遠心分離機で組織培養上清を4°Cで10分間2,000xgで回収し、細胞破片を除去する。 rZIKVを含む上清を収穫し、細胞ペレットを廃棄する。アリコートは凍結管で上清をアリコートし、さらに救助されたrZIKVの存在を確認するために-80 °Cでそれらを保存します。 4. 回収されたrZIKVの滴定 滴定の前日、12ウェルプレート上の種子2.5 x 105ベロ細胞/ウェル成長培地で滴定時までに90%のコンフルエント細胞単層を上昇させる。注:回収されたrZIKVの滴定を三つトリケートで行うことはお勧めします。 冷凍庫から上清のアリコートを取り出し(ステップ3.8)、FBSなしで成長培地で連続10倍の希釈を行います。 ベロ細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2倍洗浄し、各ウイルス希釈の200 μL/ウェルを三重に加えます。プレートを5%CO2加湿インキュベーターに37°Cで置き、90分間15分ごとに岩を打ちます。 ウイルス接種を取り除き、2S、1AE-dextran、および0.6%寒天貴族を含む成長培地の2mLで細胞をオーバーレイし、3〜4日間5%CO2の下で37°Cでインキュベートする。注:アガロース、メチルセルロース、または他のオーバーレイ媒体を使用することが可能です。適切なプラーク形成の時間は、使用されるオーバーレイとZIKV株によって異なります。 ZIKV感染細胞を室温でPBSで希釈した4%ホルムアルデヒドを1mL/ウェルで固定し、オーバーレイを除去し、室温で20%メタノールで0.1%の結晶バイオレットで15分間染色してウイルスプラークを可視化する。 結晶バイオレットを捨て、水で3倍洗い、プレートを乾燥させ、手動でプラークを数えます(図4C、左パネル)。ウイルスチターは、1ミリリットル当たりのプラーク形成単位(PFU/ml)として計算される。 あるいは、ウイルスプラークは、pan-flavivirus Eタンパク質マウスモノクローナル抗体(mAb)4G2(図4C、右パネル)による免疫染色により可視化することができる。 免疫染色によりZIKVプラークを評価するには、上述のようにオーバーレイ寒天の固定および除去後(ステップ4.5)、細胞をPBSで2倍に洗浄し、室温で15分間PBSで200 μL/ウェル0.5%のトリトン-X100をインキュベーションして透過させます。 透過性溶液を取り出し、細胞をPBSで3倍洗浄し、200μL/ウェルのブロッキング溶液(PBSで10S)で室温で1時間ブロックします。注:その他の標準的なブロッキングソリューション(例えば、PBSの2.5%BSA)は、このステップで使用することができる。 ブロッキング溶液を除去し、37°Cで1時間のブロッキング溶液(1μg/mL)で希釈したパンフラビウイルスEタンパク質mAb 4G2の200μL/ウェルで細胞をインキュベートします。注:他のmAbまたはポリクローナル抗体(pAb)は、ウイルスプラークの免疫染色および検出のために4G2の代わりに使用することができる。 細胞をPBSで3倍洗浄し、37°Cで1時間のブロッキング溶液中で希釈したビオチン化抗マウス二次抗体(メーカーの推奨に従って)の200μLでインキュベートします。 二次抗体を取り除き、PBSで細胞を4倍に洗浄し、メーカーの仕様に従ってアビジン/ビオチンベースのペルオキシダーゼキットを使用してウイルスプラークを可視化します(材料の表を参照)。 5. 成功したrZIKV救助の確認 注:駆出したウイルスの同一性をさらに確認するために、ZIKV Eタンパク質発現は、ZIKV Eタンパク質に特異的なマウスmAb 1176-56を用いて免疫蛍光によって分析される(図4D)。このmAbは、汎フラビウイルスEタンパク質mAb 4G2の状況とは対照的に、ZIKV Eタンパク質に特異的である(ステップ4.6.3)。あるいは、ウイルスのアイデンティティは、シーケンスによって確認することができる。 免疫蛍光分析の前日、種子は、感染時までに90%のコンフルエント細胞単層を上げるために成長培地で1 x 105ベロ細胞/ウェルを含む24ウェルプレートでスリップします。 細胞をPBSで2倍洗い、FBS(100 μL/ウェル)を含まない増殖培地で救助されたウイルスの0.5 PFU/細胞の多重感染(MOI)に感染します。プレートを37°Cで90分間インキュベートします。 ウイルス吸着後、ウイルス接種を除去し、2Sで新鮮な成長培地の0.5mLを加え、37°Cで5%CO2加湿インキュベーターで細胞を48時間インキュベートする。 組織培養上清を取り除き、室温で20分間PBSで4%パラホルムアルデヒドの150μL/ウェルで細胞を固定し、室温で150μL/ウェル0.5%のトリトン-X100で細胞を透過化します。 透過性溶液を除去し、PBSで細胞を3倍に洗浄した後、室温で1時間の間に150μL/ウェルのブロッキング溶液で細胞をブロックする。注:細胞スキャンは、代替ブロッキング溶液(例えば、PBSの2.5%BSA)でブロックされる。 ブロッキング溶液を除去し、mAb 1176-56の100 μL/ウェルで細胞をインキュベートし、ZIKV Eタンパク質に特異的に、37°Cで1時間のブロッキング溶液(1μg/mL)で希釈する。 細胞をPBSで3倍洗浄し、Alexa Fluor 488-共役抗マウス二次抗体を100μL/ウェルで室温で1時間インキュベートし、ブロッキング溶液中で希釈した(メーカーの推奨に従って)ブロック溶液で細胞を広範囲に洗浄し、かつ、4′,6′-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI;1mg/mL)の150 μL/ウェルを室温で1:200に希釈し、室温で10分間浸入します。 細胞をPBSで3倍洗い、アンチフェード取り付け媒体にカバーリップを取り付け(材料の表を参照)、蛍光顕微鏡下でサンプルを分析します。注:長期保存の場合は、光から保護された4°Cでサンプルを保管してください。 6. ウイルス株の増幅と生成 注:救出されたウイルスの同一性が確認されたら(セクション5)、Vero細胞上のウイルスを増幅し、さらなる研究のためにウイルスストックを生成する。 90%の合流点で100mm x 21 mmプレートでベロ細胞を成長させ、前述のように0.1 PFU/セルのMOIで感染させます。 CPEが約75%(約48〜72時間の感染後)である場合は、50 mL円錐管で組織培養上清を採取し、4°Cで10分間2,000 x gで組織培養上清を回収し、細胞の破片を除去する。 rZIKVを含む上清を収穫し、細胞ペレットを廃棄する。アリコートは、クライオチューブで上清をアリコートし、-80 °Cでそれらを保存します。 冷凍庫からウイルスアリコートを取り出し、前述のプラークアッセイでウイルス価火量を決定する(セクション4)。