Un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno In Vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógeno sorgénicos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia
Summary
Clínicamente, la deficiencia de estrógeno en mujeres menopáusicas puede agravar la incidencia de trastornos lipídicos y aterosclerosis. Establecimos un modelo de deficiencia de estrógeno in vivo por ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/-. El modelo de ratón es aplicable para el cribado de tratamientos de estrógeno exógeno de disfunción cardiovascular después de la menopausia.
Abstract
Las mujeres posmenopáusicas corren un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares que las mujeres premenopáusicas. Los ratones hembra ovariectomizados (OVX) en la exhibición de destete muestran un aumento de las lesiones ateroscleróticas en la aorta en comparación con los ratones hembra con la función ovárica intacta. Sin embargo, faltan modelos de laboratorio que involucran ratones con deficiencia de estrógeno con estado propenso a la aterosclerosis. Este déficit es crucial porque la deficiencia clínica de estrógeno en mujeres menopáusicas puede agravar la incidencia de la alteración de lípidos preexistentes o en curso y la aterosclerosis. En este estudio, establecemos un modelo de ratón in vivo con deficiencia de estrógeno por ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en apolipoproteína E (apoE)-/- ratones. A continuación, comparamos los efectos de 17o-estradiol y pseudoprotodioscina (PPD) (un fitoestrógeno) perorgénicamente administrados a través de la propagación de avellanas. Encontramos que aunque ppD ejerce algún efecto en la reducción del peso corporal final y el TG plasmático en ratones OVX apoE-/-, tiene capacidades anti-ateroscleróticas y olascitoras comparables con su contraparte de 17o-estradiol. La PPD es un fitoestrógeno que se ha divulgado para ejercer propiedades antitumorales. Por lo tanto, el método propuesto es aplicable para el cribado de fitoestrógenos a través de la administración peroral para sustituir la terapia tradicional de reemplazo hormonal en mujeres posmenopáusicas, que se ha informado que tiene potencialmente perjudicial tumorigenetica Capacidad. La administración peroral a través de la propagación de avellanas no es invasiva, por lo que es ampliamente aplicable a muchos pacientes. Este artículo contiene demostraciones paso a paso de la ovariectomía bilateral a través de la doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/- y reemplazo peroral 17o-estradiol o hormona fitoestrógeno a través de la propagación de avellanas. Siguen los análisis de lípidos plasmáticos y de la función cardiovascular mediante ecocardiografía.
Introduction
Los estudios epidemiológicos y clínicos han demostrado que las mujeres posmenopáusicas tienen un riesgo considerablemente mayor de enfermedad cardiovascular que las mujeres premenopáusicas1,2. La terapia de reemplazo hormonal (HRT) puede reducir el riesgo relativo de enfermedad cardiovascular a 0,37-0,793. Entre otras complicaciones, la aterosclerosis causada por enfermedades cardiovasculares es la principal causa de muerte en todo el mundo4. Sin embargo, faltan modelos de laboratorio que involucran ratones con deficiencia de estrógeno que presentan un estado propenso a la aterosclerosis. Este protocolo proporciona un modelo de ratón por deficiencia de estrógeno in vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógenos de disfunción cardiovascular después de la menopausia.
Estudios anteriores muestran que la aplicación de OVX en roedores aterosclerósicos alimentados con una dieta alta en colesterol puede imitar a las mujeres posmenopáusicas que sufren de aterosclerosis5,6,7,8. Un modelo animal reproducible y conveniente que se asemeja al estado aterosclerógeno en las mujeres menopáusicas es la base de la investigación de estrógenoexógenos. Aquí, se aplicó una doble incisión dorsal-lateral de la ovariectomía bilateral en ratones propensos a la aterosclerosis E knockout (apoE-/-)9,10. En comparación con la incisión abdominal o dorsal media, la incisión dorsal doble es un método más fácil y lento que puede evitar la adhesión e inflamación graves de la cavidad abdominal. La administración peroral a través de la propagación de avellanas (ver Tabla de Materiales)no es invasiva y conveniente, por lo que es ampliamente aplicable como modo de administración a largo plazo11. La implantación de pellets de liberación lenta también es popular6. Sin embargo, los implantes pueden agravar la incidencia de infección, especialmente en ratones sometidos a OVX. Otros modos de administración no invasivos, como el gavage oral y la administración del agua, también tienen muchos inconvenientes. Por lo general, el avalo oral estresa a los ratones y puede causar lesiones esofágicas. La administración de la hormona a través del agua potable es altamente beneficioso; sin embargo, la adición de DMSO como emulsionante es inevitable ya que los estrógenos exógenos son insolubles en agua. Aquí, elegimos el reemplazo de hormona peroral 17o-estradiol o fitoestrógeno a través de la propagación de avellanas para la administración a largo plazo.
Recientemente, el efecto beneficioso de la HRT en el sistema cardiovascular de las mujeres posmenopáusicas se ha disputado en los ensayos12de la iniciativa de salud de la mujer (WHI). Por un lado, estrógeno exógeno por sí solo ejerce un efecto beneficioso sobre el sistema cardiovascular; por otro lado, se puede combinar con acetato de metohidroxiprogesterona para aumentar el riesgo de eventos cardiovasculares. Más en serio, HRT puede conducir a la progresión de la mama y el tumor uterino, y este efecto ha limitado notablemente su uso13,14. Más interés se ha centrado en los efectos cardiovasculares-protectores de los estrógenos exógenos que carecen de actividad mitotica en las células tumorales15,16,17. Múltiples estudios en seres humanos y animales sugieren que los fitoestrógenos con estructuras similares a la de los estrógenos pueden desempeñar un papel beneficioso en la protección cardiovascular15,18.
Por lo tanto, los objetivos del presente trabajo son (i) construir un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno in vivo mediante ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/- y (ii) comparar los efectos protectores cardiovasculares de peroalmente administrado 17o-estradiol y pseudoprotodioscina (PPD), a través de la propagación de avellanas. 17o-estradiol es un tipo de estrógeno exógenoque pertenece a las hormonas sexuales femeninas 6,11,19. PPD, un esteroide saponina y fitoestrógeno de plantas de Dioscorea, se ha divulgado previamente para ejercer propiedades antitumorales20.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodología descrita aquí es un modelo de ratón que se asemeja a la alteración de los lípidos y la aterosclerosis vista en las mujeres menopáusicas. Está bien documentado que la deficiencia de estrógeno en mujeres posmenopáusicas puede agravar la incidencia de hipercolesterolemia preexistente o en curso con lesiones aterosclerosósticas progresivamente complejas y generalizadas1. Para imitar el estado propenso a la aterosclerosis en la clínica, se aplicaron ratones apoE deficientes, u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81202526 a J.X.), la National Natural Science Foundation of China (81302769 a B.S.), la Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 a B.S.), la China Postdoctoral Science Foundation (20110490325 a J.X.), y la Fundación de Programas de Doctorado del Ministerio de Educación de China (20121106120031 a B.S.).
Materials
| 17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | Estrogen |
| Disposable syringes (with 25G needles) | Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd | 0.5*19TWLB | Cardiac bleeding |
| High-cholesterol mouse diet | Huafukang Bio-Technology | N/A | 1.25% cholesterol, 0% cholate |
| High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System | VisualSonics | Vevo®770 | Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463-250ML | Preparation of avertin |
| Micro Dissecting forceps, Curved 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting forceps, Straight 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Monofilament suture 4-0 1/2 5*12 19mm | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | R413 | Suture and ligation of the tissues |
| Nut cream (Nutella) | Ferrero | N/A | Medium for peroral 17β-estradiol or PPD |
| OptiVisor optical glass binocular magnifier | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | Assistant of identifying the tissues during ovariectomy |
| Phosphate-buffered saline at pH 7.4 | SIGMA | P3813 | Preparing 1 L saline |
| Pro MultiLabel Microplate Reader | Tecan | Infinite M1000 | Plasma TC and TG determination |
| Pseudoprotodioscin | Shanghai Winherb Medical S & T Development | W-0427 | CAS registry no. 102115-79-7 |
| Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Postoperative analgesia after ovariectomy |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Dissolving the 17β-estradiol or PPD |
| Solcoseryl Eye-Gel | Menarini, Solco Basle Ltd. | Eye protection during anesthesia | |
| Stereo microscope | MCALON | MCL-6STV | Image of the intimal region of aorta |
| Table model high speed centrifuge | SIGMA | 1-14K | Preparation of plasma |
| Scissors, slight Curve (14cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Scissors, straight Flat (14cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tissue forceps, serrated, slight Curve (14cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tissue forceps, serrated, straight Flat (14cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | Preparation of avertin |
| Triglycerides (TG) assay kit | Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering | A110-1 | Plasma TG determination |
| Total cholesterols (TC) assay kit | Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering | A111-1 | Plasma TC determination |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
- Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
- Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
- Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
- Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
- Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
- Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women’s Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
- Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
- Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
- Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
- Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
- Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
- Guivarc’h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
- Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
- Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
- Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
- Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
- Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
- Keaney, J. F., et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
- Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
- Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
- Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
- Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
- Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
- Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).
