효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

1. 니 둘 란 스의 재배 접종 물 준비주: 인큐베이션과는 별개로 모든 단계는 층 류 캐비닛에서 수행 해야 합니다. 연속 탭 스트레인 (예를 들어 tib 32.1)에서 글리세롤 스톡 (-80 ° c)에서 포도 당/자일 로스 최소 배지 (gxmm; 당 리터 10.0의 포도 당 0.5 g의 혈당, 10ml(1m의 디 암모늄 타르트 레이트 50 용액 20ml × 염 26.0 용액 20ml KCl, 26.0 g · 7h2o, 76.0의 클로로포 름 1 ml), 1.5%의 한 천을 포함 하는 1000 × 허 트 너의 미 량 원소8) 및 토 드 외. 20079에 기술 된 바와 같이 필요한 보조 제. 37 ° c에서 2 ~ 3 일 동안 배양 합니다.참고: TIB 32.1에는 Rpda가 포함 되어 있습니다:: 탭 융합은 자일 로스-유도성 프로모터, xylp(p.10)에 의해 제어 된다. 이것이 자일 로스가 위의 레시피에 포함 된 이유입니다. Xylp(p) 컨트롤 아래에 있지 않은 구조를 표현 하는 균 주를 재배 할 때 자일 로스를 생략 하십시오. 멸 균 된 침 엽 다이얼 서 스 펜 션 솔루션 (80 polysorbate의 0.9%) 염화 나트륨, 0.01% (v/v)를 1.5 가진 멸 균 1.5 ml 원심 분리기 튜브를 준비 합니다. CSS에서 일회용 접종 루프를 적시고 1.1.1 단계에서 플레이트에서 침 엽 직경을 긁어 내 고 1.1.2 단계에서 튜브를 일시 중단 합니다. 전송 150 µ L는 10 25의 보충 및 200 µ L 을 포함 하 여 GXMM 한 천을 포함 하는 벤 트 캡이 들어 있는 침 엽 다이얼 서 스 펜 션의 각각의 구 수로 각이 있습니다. 멸 균 접종 루프를 사용 하 여 플라스 크 내 침 엽 다이얼 현 탁 액을 확산 하 고 2 ~ 3 일 동안 37 ° c에서 플라스 크를 배양 합니다. 침 엽 직경을 수확 하려면 플라스 크 당 10 mL의 CSS를 사용 하십시오. 용액을 플라스 크에 붓고, 제공 된 스크류 캡으로 플라스 크를 단단히 닫고 플라스 크를 세게 흔들어 줍니다. 곰 팡이 표면을 습윤 한 후, 멸 균 접종 루프로 남아 있는 침 엽 dia를 완전히 긁어 냅니다. 40 µm 세포 스 트레이너를 통해 침 엽 디 아를 통과 시켜 50 mL 원심 분리기 튜브에 넣고 하나의 튜브에서 5 플라스 크의 현 탁 액을 수집 합니다. 10 분 동안 1000 × g 에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 decant 하 고 튜브 당 CSS의 10ml로 펠 렛을 소생 시킵니다. 1.1.9 단계에서 설명한 바와 같이, 하나의 튜브에서 두 현 탁 액을 모두 모으고, 빈 튜브를 CSS의 40 mL로 헹 구 고, 현 탁 액에 추가 하 고, 원심 분리기를 사용 하십시오. 상 청 액을 decant 하 고, CSS의 4 mL에 침 엽 다이얼 펠 렛을 소생. 침 엽 다이얼 서 스 펜 션의 시리얼 1:50 희석 액을 2 개 준비 하 고, 그 결과를도11과 같이 카운팅 챔버로 생성 된 1:2, 500 희석 현 탁 액의 침 엽 수를 결정 한다. 균 사체의 성장과 수확 층 류 캐비닛 하에서 작업 하는 동안, 각각 5×106 침 엽 dia/mL의 밀도에서 적절 한 보충제를 포함 하 여 250 mL의 1 리터 원추형 플라스 크를 함유 하는 접종 하 고 14~16h의 37 ° c에서 180 rpm으로 배양 한다. 치즈 천을 플라스 크 위에 있는 깔때기에 넣고 천을 통해 균 사체를 걸러냅니다. 탈 이온 수로 간단히 씻으십시오. 첫 번째 손과 종이 타월 사이에 치즈 천에 갇힌 균 사체를 압착 하 여 최대한 많은 수 분을 제거 하십시오. 스크류 뚜껑이 있는 플라스틱 비 커에 건조 된 균 사체를 평평한 시트로 옮겨 액체 질소로 플래시를 고정 합니다. 이는 다음 동결 건조 과정에 대 한 높은 면적/부피 비를 보장 한다. 냉동 균 사체을 동결 건조 전에-80 ° c에서 보관 하십시오.참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 밤새 균 사체을 동결 건조 한다. 균 사체 온도가 일정 하 게 유지 되 면 동결 건조 과정을 중지 합니다 (18 ~ 24 시간). 비 커를 제거 하 고 제공 된 스크류 캡으로 즉시 밀봉 하십시오.참고: 단단히 밀봉 할 때, 동결 건조 균 사체 RT에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. 2. 탭 태그 HDAC의 단일 단계 보강 (Bayram 외 2012)12 버퍼 및 솔루션 준비참고: 사용 하기 바로 전에 버퍼에 진단을 (EtSH) 및 프로 테아 제 억제제를 추가 하십시오. 0.22 µm 니트로 멤브레인을 통해 크로마토그래피에 사용 되는 모든 버퍼를 필터링 하 여 크로마토그래피 수 지에 불순물/오염을 도입 하지 않도록 합니다. 아래 단계의 지침은 각 버퍼의 1 L 준비를 참조 하십시오. 4 ° c에서 버퍼를 저장 합니다. 추출 완충 액 (B250): 250 염화 나트륨, 100 mM 트리-HCl pH 7.5, 5Mmetsh의 0.1% (v/v 100) 12.35 g의 트리 스-HCl을 2.62의 트리 스 (무료 베이스) 및 탈 이온 수의 800 mL의 염화 나트륨 13.2 g을 넣고 10Ml(v/v) TX-100 용액 10ml를 첨가 한다. RT에서 pH를 확인 하 고 필요에 따라 NaOH 또는 HCl을 사용 하 여 pH 7.5으로 조정 하십시오. 최대 1l를 구성 하 고 0.22 µm 니트로 멤브레인을 통해 필터링 할 수 있습니다. 35 µ L의 EtSH를 사용 하기 바로 전에 100 mL의 완충 액 (5mm 최종 농도)에 추가 하십시오. 세척 완충 250 (WB250): 250 mM 염화 나트륨, 40 mM 트리-HCl pH 8.0, 5Mmetsh의 0.1 (v/v) B250에 대해 설명 된 바와 같이 WB250를 준비 하 되, 3.59 g의 트리-HCl과 2.08 g의 트리 (프리 베이스)를 사용 합니다. 세척 완충 150 (WB150): 150 mM 염화 나트륨, 40 mM 트리-HCl pH 8.0, 5Mmetsh의 0.1 (v/v) B250에 대해 설명 된 바와 같이 WB150를 준비 하 되, 3.59 g의 트리 트리-HCl을 2.08의 트리 트리 (유리 염기) 및 8.77 g의 염화 나트륨으로 제조 하였다. TEV 평형 완충 액 (TEV): 150 염화 나트륨, 40 mM 트리 스-HCl의 pH 8.0, 0.5 m-0.1, 5mm EtSH. WB150와 동일 하지만 EDTA를 0.5 최종 농도로 추가 합니다. Tev 절단 버퍼 (TCB): 150 mm 염화 염, 40 mm 인 트리 스-HCl의 pH 0.1 0.5 8.0, 5mm~10% (v/v) 글리세롤, 5mm etsh. 2.1.1 단계에서 설명 된 대로 준비 하 고 3.59 g의 트리 스-HCl을 2.08 g의 트리 (유리 염기) 및 염화 나트륨 8.77 g을 사용 하 여 부피를 1l로 조절 하기 전에 글리세롤의 100 mL을 첨가 한다. 50 × 프로 테아 제 억제제 칵테일: 시판 되는 프로 테아 제 억제제의 1 정을 1 mL의 물에 녹여-20°c에서 보관 한다. 50의 경우 트리 트리-HCl pH 7.6, 0.9%의 염화 나트륨, 0.1% (v) polysorbate 2.1.1 단계에서 설명한 대로 준비 합니다. 6.06 g의 트리 트리-HCl 1.40 g, 염화 나트륨 polysorbate, 1Ml의 1 mL를 사용 합니다. 5 × LSB (Laemmli 샘플 버퍼): 315 mM 트리 스-HCl pH 6.8, 105v(v/v) 글리세롤, 0.05% (v) 브로 모 페 놀 블루 .이 하에는 510(50 v/v) 단백질 추출 물의 제조 볼 밀의 분쇄 용기에 동결 건조 균 사체 분쇄 공을 1.5 g 추가 하십시오.참고: 신선한 균 사체도 사용할 수 있습니다. 그렇게 할 때, 동결 전에 가능한 한 완전히 균 사체 건조 하 고 신선한 균 사체을 분쇄 하기 위한 액체 질소의 분쇄 항아리를 미리 냉각 해야 합니다. 30 초 동안 25hz에서 균 사체 분말로 갈아 냅니다.참고: 연 삭 기를 사용할 수 없는 경우에는 Bayram et al 에 설명 된 바와 같이 박격포와 유 봉 (균 사체)을 사용 하 여 분말로 갈아 냅니다. 12. 균 사체 분말을 15 mL 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 그라운드 균 사체를 포함 한 원심 분리기 튜브를 기울여 버퍼와 균 사체의 후속 혼합을 허용 합니다. 균 사체 파우더 그램 당 1 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함 한 아이스 콜드 B250 6 mL를 첨가 하 고, 조 추출 물의 완전 한 균질 화를 달성할 때까지 작은 주걱으로 블렌딩 한다. 신선한 균 사체를 사용 하는 경우, Bayram et al 을 참조 하십시오. 12 . 추출 버퍼 비율에 적합 한 바이오 매스를 달성 한다. 튜브를 얼음에 5 분간 보관 하십시오. 튜브와 평형 튜브를 원심 분리기에 놓고 4만 × g 에서 4 ° c에서 20 분 이상 회전 합니다. 상기 원심 분리 시 IgG 수 지 (단계 2.3)의 평형을 수행 한다. 원심 분리 후, 상 청 액의 10 µ L을 제거 하 여 SDS-PAGE 분석을 한다. 40 µ의 물과 12.5 µ L의 5 × LSB를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 샘플을 놓습니다. 그림 1에서 “Ex” 라고 합니다. 세 혈 학 피 펫을 이용 하 여 상층 액 (제거 된 파쇄 물)을 조심 스럽게 제거한 후, 제공 된 말단 캡을 이용 하 여 긴밀 하 게 밀착 된 IgG 비드 (단계 2.3)를 포함 하는 칼럼 상에 전사 한다. IgG 수 지의 평형 화 (단계 2.2.7 중에 수행 됨) 열에 재현 탁 IgG 수 지 (50% 슬러리)의 10 mL 일회용 크로마토그래피 컬럼 및 pipet 300 µ L을 준비 한다. B250를 사용 하 여 열을 10ml로 채우고 버퍼가 중력을 통과 하도록 합니다. 1 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함 한 B250 1 mL를 첨가 하 고 흐르는 것을 보자. 기둥의 하단을 연결 합니다. 탭 태그 HDAC의 배치 정제 회전 믹서에서 2.2.9 단계부터 2 ~ 4 시간 동안 4°c에서 10rpm으로 평형 화 비드 및 제거 된 파쇄 물이 포함 된 크로마토그래피 컬럼을 배양 합니다. 배치 바인딩 후, 캡을 제거 하 고 아래쪽의 열을 열어 플로우 스루를 수집 합니다. 2.2.8 단계에서 설명한 대로 SDS-PAGE 분석을 위한 샘플을 가져가 라. 그림 1에서 “FT” 라고 합니다. WB250 10ml의 구슬 세척. 먼저, 1 mL의 완충 액을 사용 하 여 칼럼 캡에서 트랩 된 비드를 제거 하 고이 현 탁 액을 침전 된 수 지에 한 플러시로 옮겨 구슬의 소생을 허용 합니다. 그런 다음 기둥을 상단에 채우고 스택 캡을 사용 하 여 닫은 후 연동 펌프에 연결 합니다. 유량을 약 1 ~ 5ml/min으로 조절 합니다. 수 지가 건조 하 게 작동 하지 않도록 합니다. 2.4.4 단계를 3 번 반복 하 여 총 4 회 세척을 WB250. 2.4.4 단계에서 설명한 바와 같이 10ml의 TEB로 비드를 세 번 씻으십시오. 하단에 있는 크로마토그래피 칼럼을 닫고, TCB 1 mL의 IgG 비드를 분해 하 고 50 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 20 µ, tev(~1~1mg/ml 스톡 S219V 돌연변이 변이체를 생성 하는 10 µ l)를 첨가 한다. 칼럼에 캡을 하 고 4 ° c에서 10 rpm으로 회전 혼합기에서 배양 하 여 태그 드 HDAC를 통해 결합 된 단백질 복합체를 용 출 시킨다.참고: 또한 온도 (16~25°c)에서 TEV 다이제스트를 수행 하 여 반응 시간을 단축 시킬 수 있지만 단백질 분해의 위험을 높이는 것입니다. 다음날 열을 열고 2 mL 원심 분리기 튜브에 용 출 액를 수집 합니다. 0.7 mL의 TCB를 사용 하 여 뚜껑에서 구슬을 제거 하 고 기둥의 벽을 헹 굽 니다. 그 자체가 50 mL 원심 분리기 튜브 내에 배치 되는 이전 단계에서 열린 2 mL 튜브에 컬럼을 놓습니다. 이 조립품을 테이블 상단 원심 분리기로 전송 하 고 2 분 동안 300 × g 에서 회전 시킵니다. 이것은 TEV 용 출 액.주: 탠덤 선호도 정제를 수행할 때 cal모듈화 선호도 단계에 대 한 입력으로 TEV 용 출 액를 사용 합니다. 또한 TEV 용 출 액를 분할 하 고 HDAC 활동 결정을 위해 한 부분을 사용 하 고 두 번째 부분은 탭 정제를 완료 할 수 있습니다. TEV 용 출 액에서 50 µ L을 제거 하 고 SDS 페이지 ( 그림 1 및 2에서 ‘ TE ‘ 라고 함)의 12.5 µ l을 추가 하 고 나머지 용 출 액을 얼음에 보관 하십시오. 프로 테아 제 용 출의 효능을 평가 하기 위해, 5%의 아세트산을 2 mL를 넣고 5 분간 RT에서 배양 한다. 다시, 첫 번째 mL을 사용 하 여 수 지를 소생 시킵니다. 산 용 출 액를 수집 하 고 다시 50 µ L 샘플을가지고 5 × LSB의 12.5 µ L을 추가 ( 그림 1에서 “AE” 라고 함). 산 성 용액에 첨가 하면 LSB 황색으로 바뀝니다. 산을 중화 시키기 위해 1 µ L의 단계에서 10 M NaOH를 추가 하 고 색상이 다시 파란색으로 바뀔 때까지 잘 섞어 줍니다. IgG 수 지를 TBS-T로 평형을 다시 하 여 산을 중화 시킵니다. 수 지를 4°c에서 TBS-T20v(v/v) 에탄올에 보관 하 여 동일한 태그 단백질로 재사용 하십시오. 용 출 분 획의 저장 용 출 액는 ~ 100 µ L 분 획으로 여러 동결-해 동 주기를 피하기 위해. 액체 질소의 분 취를 동결 하 고-80 ° c에서 유지 하십시오.참고:이 방법으로 저장 된 샘플은 효소 활동을 잃지 않고 수개월 동안 안정적입니다. 3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에의 한 정제의 분석 표준 프로토콜을 사용 하 여 SDS 폴 리 아크릴 아 미드 겔을 주조 하거나 프리 캐스트 겔을 사용 합니다. 이전 섹션에서 5 분 동안 95 ° c에서 겔 샘플을 변성 하 고, ≥ 15000 × g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 12% 젤에 적재 합니다. 권장 되는 로드 볼륨은 그림 1의 범례에 나와 있습니다. 샘플을 1 × 트리 스-글리신의 SDS-PAGE 실행 버퍼에서 60 ~ 70 분간 일정 하 게 하 고, SDS-PAGE 로딩 버퍼의 브로 모 페 놀의 블루 마커가 겔 밖으로 마이그레이션하기 시작할 때까지 전 180. 젤의은 염색에는 표준 프로토콜을 사용 합니다. 예를 들어, Blum et al 프로토콜을 사용 합니다. 198714 는 MS 분석과도 호환 됩니다. 웨스턴 블로 팅15에 표준 프로토콜을 사용 합니다. 대표적인 결과의 생성을 위해, 시판 되는 블 롯 시스템을 사용 하였다. 시판 되는 항-cal모듈화 결합 단백질 (안티 CBP) 항 체를 포함 하는 프로브 블 롯은 4°c에서 하룻밤 동안 5%의 우유 분말로 밀크 파우더를 사용 한다.참고: 안티-CBP 항 체는 TEV 절단 후 여전히 존재 하는 탭 태그의 부분에 대 한 지시. Blots의 검색 및 개발에 표준 프로토콜을 사용 합니다. 예를 들어, 항-토끼 IgG-알칼리 성 인산 가수분해 효소 결합체 및 BCIP/NBT 색 개발 기질은 아래의 대표적인 결과의 생성을 위해 사용 되었다. 4. 시험관 내에서 사용 하는 데 아세틸 제 분석 [3 시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 망상 히 돌 (트 로 지에 적응 2003)4 [3시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 망상 히 돌의 제조를 위해 kölle 외. 199816 의 프로토콜을 참조 하십시오. 분석 조건 당 3 개의 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 얼음에 넣고 삼중으로 측정 합니다. 또한 버퍼 전용 배경 제어를 위해 세 개의 튜브를 준비 합니다. 각 튜브에 WB150 25 µ L을 넣고 단계 2.4.11에서 TEV 용 출 액의 25 µ L을 추가 하 고 얼음을 유지 합니다. 튜브 인큐베이터를 25°c로 예 열 합니다. 각 튜브에 라벨링 된 하이 스톤 [1.5 밀리 리터]의 10 µ L을 추가 하기 위해 15 초 간격 (스톱 워치)을 사용 하십시오. 분석을 시작 하기 전에 [3시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 히 돌의 10 µ l을 차지 하 고 스톱 워치를 시작 합니다. 시작 후 5 초 후에 레이블이 붙은 histones를 추가 하 고 튜브를 단단히 닫고 소용돌이를 인큐베이터에 넣습니다. 레이블이 지정 된 히스톤의 10 µ l을 추가 하기 위해 15 초 간격을 사용 하 고 이전 단계에서 설명한 대로 진행 합니다. 60 분 인큐베이션 후에 각 튜브에 15 초 간격으로 50 µ L의 스톱 용액 (1m HCl/0.4m 아세트산)을 첨가 한다. 소용돌이가 즉시. 산 성 용액의 첨가 후, 어 세이 믹스는 안정 하 고 다음 단계까지 RT에서 유지 될 수 있다. 각 튜브에 800 µ L의 에틸 아세테이트를 첨가 하 여 방출 된 [3시간] 아세트산을 추출 한다. 5 초 동안 튜브와 소용돌이 각 튜브를 단단히 닫습니다. 튜브를 마이크로 원심 분리기에 넣고 RT에서 10 분 동안 1만 × g 로 돌립니다. 그 동안에, 분석 샘플 당 하나의 섬광 유리병을 준비 하 고 소수 성 샘플에 대 한 3 mL의 섬광 칵테일을 추가 합니다. 원심 분리 후 (단계 2.12), 상부 유기 물의 600 µ L을 준비한 섬광 관에 조심 스럽게 전달 하 고 튜브를 단단히 닫습니다. 액체 섬광 카운터에서 HDAC 활성에 상응 하는 방사능을 측정 한다.