糸状菌のタップタグ付きヒストンデアセチラーゼのシングルステップエンリッチメント酵素活性アッセイのためのカビnidulans

1. nidulansの栽培 接種準備注: インキュベーションから離れたすべてのステップは、層流キャビネットの下で実行する必要があります。 (例: tib 32.12)、グリセロールストック (-80 ° c) からグルコース/キシロースの最小培地 (1 リットル当たりの GXMM) へのひずみ (1 リッターあたり、10.0 g のグルコース、0.5 g のキシロース、20ml の1ml の溶液、20 ml の50×塩溶液 (リットル当たり 26.0 g)KCl, 26.0 g MgSO4 ·7 H2O, 76.0 g KH2PO4, 1 mL のクロロホルム], 1 ml の1000× Hutner の微量元素8) 1.5%(w/v) 寒天およびトッドet al. 20079によって記述されている必要なサプリメントを含む。37° c で 2 ~ 3 日間インキュベートします。注: TIB 32.1 は、キシロース誘導性プロモーター、 xylP(p)10によって制御されるrpdA:: TAP fusion を含んでいます。これが、キシロースが上記のレシピに含まれている理由です。XylP(p) 制御下にないコンストラクトを発現する菌株を増殖させる場合にはキシロースを省略する。 滅菌 conidial 懸濁液 (CSS; 0.9%(w/v) NaCl、0.01% (v/v) ポリソルベート 80) の無菌 1.5 ml 遠心1.5 チューブを準備してください。 CSS で使い捨て接種ループを濡らし、ステップ1.1.1 から分生子をプレートから削り出し、ステップ1.1.2 からチューブに懸濁させる。 150μ l をそれぞれ conidial 懸濁液を含む GXMM 寒天を含有するベントキャップを 10 25 cm2 の細胞培養フラスコに移し、その中には CSS のサプリメントおよび200μ l を転写する。 無菌接種ループを使用して conidial 懸濁液をフラスコ内に広げ、37° c で 2 ~ 3 日間フラスコをインキュベートします。 分生子を収穫するには、フラスコあたり 10 mL の CSS を使用してください。溶液をフラスコに注ぎ、付属のスクリューキャップでフラスコをしっかりと閉じ、フラスコを激しく振ってください。 真菌表面を湿潤させると、残留した分生子を無菌の接種ループで完全に掻き取る。 40μ m の細胞こし器を通して生殖不能の 50 mL の遠心管の上に置き、1つの管の5つのフラスコの懸濁液を集めなさい。 チューブを1000× gで10分間遠心します。 上清をデカントし、チューブあたり 10 mL の CSS でペレットを再懸濁します。 1つのチューブで両方の懸濁液を収集し、40 mL の CSS で空のチューブをすすぎ、懸濁液に追加し、ステップ1.1.9 で説明したように遠心分離します。 上清をデカントし、CSS の 4 mL で conidial ペレットを再懸濁します。 Conidial 懸濁液の2つの連続1:50 希釈液を調製し、得られた 1: 2, 500-希釈懸濁物中の分生子の数を11記載の計数室とともに決定する。 菌糸体の成長と収穫 層流キャビネットの下で作業しながら、それぞれ5×106分生子/ml の濃度で適切なサプリメントを含む GXMM の 250 mL を含む 4-6 1 リットルの円錐フラスコを接種し、37° c で 14-16 h で180インキュベートします。 チーズクロスをフラスコの上の漏斗に置き、布を通して菌糸体をろ過します。脱イオン水で簡単に洗ってください。 最初の手とペーパータオルの間にチーズクロスに閉じ込められた菌糸体を絞ることによって、できるだけ多くの水分を除去します。 乾燥した菌糸体を平らなシートとして、ネジ蓋とフラッシュ凍結を液体窒素でプラスチックビーカーに移します。これは次の凍結乾燥プロセスのための高い面積/容積の比率を保障する。 冷凍菌糸体は、凍結乾燥の前に-80 ° c で保管してください。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 菌糸体を一晩 Lyophilize。 菌糸体の温度が一定 (18 – 24 h) のままである場合、凍結乾燥プロセスを停止します。ビーカーを取り外し、直ちに付属のスクリューキャップで密封します。注: 堅く密封されたとき、凍結乾燥した菌糸体は RT で数週間貯えることができる。 2. タップタグが付いた HDAC のシングルステップエンリッチメント (ラムet al. 2012 から適合)12 バッファーとソリューションの準備注: 使用する前に直接バッファーに 2-メルカプトエタノール (EtSH) およびプロテアーゼ阻害剤を追加してください。0.22 μ m ニトロセルロース膜のクロマトグラフィーに使用されるすべてのバッファーを濾過して、クロマトグラフィー樹脂への不純物/汚染の導入を回避します。以下の手順では、各バッファの 1 L の準備について説明します。バッファを4° c で保存します。 抽出バッファー (B250): 250 mM NaCl、100 mM トリス-HCl pH 7.5 (RT)、0.1%(v/v) TX-100、5 mM EtSH。 12.35 g のトリス-HCl、2.62 g のトリス (遊離塩基)、および 13.2 g の NaCl を脱イオン水の 800 mL とし、10 mL の 10%(v/v) TX-100 溶液を加えます。 RT で pH をチェックし、必要に応じて、NaOH または HCl [5 M] で pH 7.5 に調整します。 1 L まで作り、0.22 μ m のニトロセルロース膜を通してろ過する。 使用する前に、100 mL のバッファー (5 mM の最終濃度) に35μ l の EtSH を加えます。 洗浄緩衝液 250 (WB250): 250 mM NaCl、40 mM トリス-HCl pH 8.0 (RT)、0.1%(v/v) TX-100、5 mM EtSH。 B250 (2.1.1) について説明したように WB250 を準備しますが、3.59 g のトリス・ HCl、2.08 g のトリス (フリーベース) を使用してください。 洗浄緩衝液 150 (WB150): 150 mM NaCl、40 mM トリス-HCl pH 8.0 (RT)、0.1%(v/v) TX-100、5 mM EtSH。 B250 (2.1.1) について説明したように WB150 を調製しますが、3.59 g のトリス-HCl、2.08 g のトリス (遊離塩基)、および NaCl の 8.77 g を用いた。 TEV 平衡バッファー (TEB): 150 mM NaCl、40 mM トリス-HCl pH 8.0 (RT)、0.5 mM EDTA、0.1%(v/v) TX-100、5 mM EtSH。 WB150 と同じですが、0.5 mM の最終濃度に EDTA を追加します。 TEV 切断バッファー (TCB): 150 mM NaCl、40 mM トリス-HCl pH 8.0 (RT)、0.5 mM EDTA、0.1%(v/v) TX-100、10%(v/v) グリセロール、5 mM EtSH。 ステップ2.1.1 で説明されているように、3.59 g のトリス HCl、2.08 g のトリス (遊離塩基)、8.77 g の NaCl を使用し、容積を 1 L に調整する前にグリセロールを 100 mL 追加します。 50×プロテアーゼ阻害剤カクテル: 水 1 mL でのプロテアーゼ阻害剤の市販カクテル1錠を溶解し、-20 ° c で保存します。 TBS-T:50 mM トリス-HCl pH 7.6 (RT), 0.9%(w/v) NaCl, 0.1% (v/v) ポリソルベート 20. 手順2.1.1 で説明したように準備します。6.06 g のトリス-HCl、1.40 g のトリス (遊離塩基)、NaCl の 9 g、およびポリソルベート20の1Ml を使用してください。 5× LSB (Laemmli サンプルバッファ): 315 mM トリス HCl pH 6.8 (RT)、25%(v/v) EtSH、50%(v/v) グリセロール、10%(w/v) SDS、0.05% (w/v) ブロモフェノールブルー。 タンパク質抽出物の調製 1.5 g の凍結乾燥した菌糸体と粉砕ボールをボールミルの研削瓶に加える。注: フレッシュ菌糸体を使用することもできます。これを行うときは、凍結する前にできるだけ徹底的に菌糸体を乾燥させ、新鮮な菌糸体を研削するために液体窒素で粉砕瓶を precool ことを確認してください。 菌糸体を 25 Hz で30秒間粉砕します。注: 研削機が使用できない場合は、ラムet al.に記載されているように、モルタルと乳棒を使用して菌糸体を粉末に粉砕します。12です。 菌糸粉末を 15 mL の遠心管に移します。 地下菌糸体を含む遠心管を傾けて、バッファーとの菌糸体の混合を可能にする。 菌糸粉末1グラム当たりの B250 を含む氷冷の混合物 6 mL を加え、粗抽出物の完全な均質化が達成されるまで小さなスパチュラでブレンドする。新鮮な菌糸体を使用する場合は、ラムet alを参照してください。12は、抽出バッファー比に適切なバイオマスを達成する。 チューブを氷上に5分間保管してください。 チューブとバランスチューブを遠心分離機に入れ、4° c で20分以上4万× gで回転させる。遠心分離の際に IgG 樹脂 (ステップ 2.3) の平衡を行う。 遠心分離後、SDS − PAGE 分析のために10μ l の上清を除去する。40μ l の水と12.5 μ l の5× LSB を含む 1.5 mL チューブにサンプルを入れます。図 1の「Ex」と称される。 血清中のピペットを使用して上清 (クリアされた溶解液) を慎重に取り出し、平衡化した IgG ビーズを含むカラムに移します (ステップ 2.3)、提供されたエンドキャップを使用してしっかりと閉じます。 IgG 樹脂の平衡化 (ステップ2.2.7 中に行われる) 10 mL 使い捨てクロマトグラフィーカラムと pipet 300 μ l の十分に再懸濁された IgG 樹脂 (50% スラリー) をカラムに調製します。B250 でカラムを 10 mL まで充填し、バッファーが重力によって流れるようにします。 1×プロテアーゼ阻害剤カクテルをはじめとする B250 を 1 mL 添加して流す。列の下部を差し込みます。 タップタグ HDAC のバッチ精製 平衡化したビーズを含むクロマトグラフィーカラムおよびステップ2.2.9 からのクリアされたライセートを4° c で 10 rpm で 2 ~ 4 時間インキュベートします。 バッチバインディングの後、キャップを外し、下部の列を開いてフロースルーを収集します。 ステップ2.2.8 で説明されているように、SDS-PAGE 分析のサンプルを取得します。図 1の “FT” と呼ばれます。 10 mL の WB250 でビーズを洗ってください。まず、バッファー 1 mL を使用して、pipettor を使用してカラムキャップからトラップされたビーズを除去し、この懸濁液を1つのフラッシュに移して沈殿物の再懸濁を可能にします。その後、スタックキャップを使用して閉じて、上部に列を記入し、蠕動ポンプに接続します。流量を約 1 ~ 5 mL/min に調整します。レジンの乾燥を防ぎます。 WB250 で4回の洗浄を合計してステップ2.4.4 を3度繰り返します。 ステップ2.4.4 で説明されているように10ml の TEB でビーズを3回洗浄する。 下部にあるクロマトグラフィーカラムを閉じ、再懸濁の TCB で IgG ビーズを挿入し、50×プロテアーゼ阻害剤カクテルの 20 μl および TEV (~ 1Mg/mL の株) を加え、S219V 変異型を社内で製造しました。 カラムをキャップし、4° c で 10 rpm で回転ミキサーにインキュベートして、タグ付き HDAC を介して結合されたタンパク質複合体を溶出します。注: 一方、高温 (16 ~ 25 ° c) で TEV ダイジェストを行うと、反応時間が短縮されますが、タンパク質分解のリスクが高まります。 次の日に列を開いて、2ml の遠心管で溶出液を集めます。0.7 mL の TCB を使用して、キャップからビーズを取り出し、柱の壁をすすいでください。 それ自体が 50 mL の遠心管の中に置かれる前のステップからの開いた2つの mL の管にコラムを置きなさい。 このアセンブリをテーブルトップの遠心分離機に移し、300× gで2分間回転させる。これが TEV 溶出液です。注: タンデムアフィニティー精製を実行する場合は、カルモジュリンアフィニティー・ステップの入力として TEV 溶出液を使用してください。また、TEV 溶出液を分割し、HDAC 活性判定および第2の部分をタップ精製を完了するために1つの部分を使用することができます。 TEV 溶出液から50μ l を取り出し、SDS-PAGE (図1および 2では「TE」と呼ぶ) の12.5 μ l を加えて、残りの溶出液を氷上に保持します。 プロテアーゼの溶出効果を評価するには、5%(v/v) 酢酸 2 mL を添加し、RT で5分間インキュベートします。再び、最初の mL を使用して樹脂を再懸濁します。 酸溶出液を回収し、再度50μ l のサンプルをとり、12.5 μ l の5× LSB (図 1の「AE」と称する) を加える。酸性溶液に添加すると、LSB は黄色に変わります。酸を中和するには、10 M NaOH を1μ l のステップで加え、色が再び青色に変わるまでよく混ぜる。 酸を中和するために平衡化で IgG 樹脂を再合成します。この樹脂を TBS-T/20%(v/v) エタノールで4° c で保存し、同じタグ付きタンパク質で再利用します。 溶出画分の保存 アリコートは、複数の凍結融解サイクルを回避するために、溶出液を〜100μ l 分画に分解する。 液体窒素でアリコートを凍結し、-80 ° c で維持してください。注: この方法で保存されたサンプルは、酵素活性を失うことなく、数ヶ月間安定しています。 3. SDS-PAGE およびウェスタンブロッティングによる精製分析 SDS-ポリアクリルアミドゲルの鋳造またはプレキャストゲル13の使用には、標準のプロトコルを使用します。前のセクションのゲルサンプルを95° c で5分間変性させると、≥15000× gで5分間遠心分離し、12% ゲルに負荷をかけます。推奨積載量は、図 1の凡例に記載されています。Electrophorese は、sds-PAGE ローディングバッファーのブロモフェノールブルーマーカーがゲルからの移行を開始するまでの1×トリス-グリシン SDS-ページの実行中のバッファーで、60 ~ 70 分の 180 V 定数でサンプルを使用します。 ゲルの銀染色には標準プロトコルを使用します。たとえば、ブルーム et al のプロトコルを使用します。198714 MS 分析にも対応しています。 ウェスタンブロッティング15には標準プロトコルを使用してください。下記の代表的な結果の生成のために、市販のブロッティングシステムが使用されました。 市販の抗カルモジュリン結合タンパク質 (抗 CBP) 抗体を、4° c の TBS-T で 5%(w/v) 粉乳で一晩でプローブします。注: 抗 CBP 抗体は、TEV 切断後も依然として存在するタップタグの部分に対して向けられている。 ブロットの検出および開発には、標準プロトコルを使用します。例えば、抗ウサギ IgG-アルカリホスファターゼコンジュゲートおよび BCIP/NBT カラー現像基質は、以下の代表的な結果の生成のために使用された。 4. インビトロ [3h] 酢酸標識されたニワトリ網状赤血球ヒストンを用いたデアセチラーゼアッセイ (Trojer et al. 2003 から適合)4 [3h] 酢酸標識鶏肉網状赤血球ヒストンの調製については、Kölle et al. 199816のプロトコルを参照してください。 アッセイ条件ごとに、triplicates で測定するために3つの 1.5 mL 遠心管を氷上に設置します。また、バッファ専用のバックグラウンドコントロール用に3本のチューブを用意します。 各チューブに25μ l の WB150 を入れ、ステップ2.4.11 から TEV 溶出液の25μ l を加えて氷上で維持する。 チューブインキュベーターを25° c に予熱します。 10μ l の標識されたヒストン [1.5 mg/mL] を各チューブに添加する場合は、15 s インターバル (ストップウォッチ) を使用します。 アッセイを開始する前に、[3h] 酢酸標識チキンヒストンの10μ l を取り、ストップウォッチを開始します。 開始から5秒後に、標識されたヒストンを追加し、チューブをしっかりと閉じ、渦をし、インキュベーター内に入れます。 標識されたヒストン10μ l の添加には15秒間隔を使用し、前のステップで説明したように進みます。 60分のインキュベーションの後、15秒間隔で各チューブに50μ l のストップ溶液 (1 M HCl/0.4 M 酢酸) を加えます。すぐに渦。酸性溶液を添加した後、アッセイミックスは安定しており、次のステップまで RT で保持することができます。 各チューブに800μ l の酢酸エチルを加えて、放出された [3h] 酢酸を抽出する。 しっかりとチューブを閉じ、5 s のために各チューブを渦。 チューブをマイクロ遠心に入れ、RT で10分間1万× gでスピンします。 その間、アッセイサンプルごとに1つのシンチレーションバイアルを調製し、疎水性サンプルのためのシンチレーションカクテルを 3 mL 追加します。 遠心分離 (ステップ 2.12) 後、上部有機相の600μ l を慎重に調製したシンチレーションチューブに移し、チューブをしっかりと閉じます。 液体シンチレーションカウンターで HDAC 活性に対応する放射能を測定する。