צעד אחד העשרת הברז-Tagged הידסטון Deאצטקלז של פטריה Filamentous מנידוס מינידוס לפעילות אנזימטית

1. טיפוח של א. נידולנים הכנה לרשתהערה: יש לבצע את כל הצעדים מלבד הדגירה באמצעות ארון זרימה למינארי. פס out מאמץ הקש (g. טיב 32.12) מתוך מלאי גליצרול (-80 ° c) אל גלוקוז/xylose אבד בינונית מינימלית (gxmm; ליטר: 10.0 g של גלוקוז, 0.5 g של מגרד, 10 מ ל 1 M די-אמוניום הפתרון tartrate, 20 מ ‘ 50 × תמיסת מלח [ליטר: 26.0 KCl, 26.0 g MgSO4 · 7 H2O, 76.0 g KH2PO4, 1 מ ל של כלורופורם], 1 מ ל של 1,000 × יסודות המעקב של הויטנר8) כולל 1.5% (w/v) אגר ואת התוספים הדרושים כפי שמתואר על ידי טוד et al. 20079. מודטה עבור 2 – 3 ימים ב 37 ° c.הערה: טיב 32.1 מכיל Rpda:: פיוז ‘ ן ברז נשלט על ידי מקדם מinducible הפסד, xylp(p)10. זו הסיבה קסיל כלול במתכון לעיל. השמט את xylose כאשר גדל זנים המבטא מבנים שאינם תחת שליטה Xylp(p). הכנת שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL סטרילית עם 1.5 mL של פתרון con, ההשעיה סטרילי (CSS; 0.9% (w/v) הנאל, 0.01% (v/v) polysorbate 80). להרטיב לולאה החיסון חד פעמי ב-CSS, לגרד את המחט מן הצלחת משלב 1.1.1 ולהשעות את הצינור משלב 1.1.2. העבר 150 μL כל אחד השעיית con, כדי 10 25 ס מ2 תרבות התא מבחנות עם כובע אוורור המכיל GXMM אגר כולל תוספי מזון ו200 μl של CSS. הפיצו את ההשעיה הקונאידיאל בתוך מבחנות באמצעות לולאה החיסון סטרילי ו דגירה את צלוחיות ב 37 ° c עבור 2 – 3 ימים. כדי לקצור את עצי המחט, השתמש ב-10 מ ל של CSS לכל בקבוקון. יוצקים את הפתרון לתוך בקבוקון, לסגור היטב את הבקבוקון עם כובע בורג סיפק לנער נמרצות את הבקבוקון. לאחר הרטבת משטח פטרייתי, לגרד לחלוטין את המחט הנותרים עם לולאת החיסון סטרילי. לעבור המחט דרך מ40 יקרומטר תא ממוקמים על שפופרת סטרילי 50 mL ולאסוף את ההשעיה של חמש מבחנות בצינור אחד. צנטריפוגה את הצינור ב 1,000 × g עבור 10 דקות. הדנט את הסופר והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של CSS לכל צינור. לאסוף את שתי ההשעיה בצינור אחד, לשטוף את הצינור הריק עם 40 mL של CSS, להוסיף את ההשעיה, ואת צנטריפוגה כפי שמתואר בשלב 1.1.9. הדנט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הקונאידיאל ב-4 מ ל של CSS. הכינו שני 1:50 מדלל סדרתי של ההשעיה הקונפותית וקבעו את מספר המחט בתוך 1:2, 500-מדולל ההשעיה עם תא ספירה כמתואר11. צמיחה וקציר של מיסיליה בזמן העבודה תחת הקבינט למינארי הזרימה, האיחסן 4 – 6 מבחנות חרוט ליטר אחד כל המכיל 250 mL של GXMM כולל תוספי מזון בצפיפות של 5 × 106 המחט/mL ו דגירה ב 180 rpm ב 37 ° c עבור 14 – 16 h. מניחים בד גבינה לתוך משפך על גבי בקבוקון ולסנן את תפטיר דרך הבד. רוחצים בקצרה עם מים מפוהים. הסר כמו לחות ככל האפשר על ידי לסחוט את תפטיר לכוד בתוך מטלית גבינה בין הראשון הידיים ולאחר מכן מגבות נייר. העבר את המיוסיליה היבשים כסדינים שטוחים לגביע פלסטיק עם מכסה בורג והקפא הבזק עם חנקן נוזלי. פעולה זו מבטיחה יחס של שטח/נפח גבוה עבור תהליך הליאופליזציה הבא. אחסן את המיסיליה הקפואה ב-80 ° צ’ לפני הליאופליזציה.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ליאופליז המיסיליה בן לילה. הפסיקו את תהליך ייבוש ההקפאה כאשר הטמפרטורה של מיסיליה נותרה קבועה (18 – 24 שעות). הסירו את הספלים ואטמו מיד. עם כובעי הברגים המסופקיםהערה: כאשר היא אטומה היטב, ניתן לאחסן ליאופליה במשך מספר שבועות ב-RT. 2. העשרת צעד אחד של ברז מתויג hdac (המותאם מ2012 בית bayram ואח ‘) 12 הכנת מאגרים ופתרונותהערה: הוסף 2-mercaptoethanol (EtSH) ו מעכבי פרוטאז למאגרים ישירות לפני השימוש. לסנן את כל המאגרים המשמשים כרומטוגרפיה דרך 0.22 יקרומטר ניטרוצלולוזה הקרומים כדי למנוע הקדמה של זיהומים/זהום לשרף כרומטוגרפיה. הוראות בשלבים שלהלן מתייחסות להכנת L 1 לכל מאגר. מאגרי מאגר ב-4 ° c. מאגר החילוץ (B250): 250 mM הנאסל, 100 mM טריס-HCl pH 7.5 (RT), 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ”מ EtSH. התמוססות 12.35 g של Tris-HCl, 2.62 g של טריס (בסיס חופשי), ו 13.2 g של הנאל ב 800 mL של מים מוכי מוכי להוסיף 10 מ ל של 10% (v/v) TX-100 פתרון. בדוק את ה-pH ב RT ולהתאים ל-pH 7.5 עם NaOH או HCl [5 M], במידת הצורך. לפצות על 1 L ולסנן באמצעות קרום 0.22 יקרומטר ניטרוצלולוזה. הוסף 35 μL של EtSH לכל 100 mL של מאגר (5 מילימטר הריכוז הסופי) ישירות לפני השימוש. מאגר כביסה 250 (WB250): 250 mM הנאסל, 40 mM טריס-HCl pH 8.0 (RT), 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ”מ EtSH. להכין WB250 כמתואר עבור B250 (2.1.1) אבל עם 3.59 g של טריס-HCl, ו 2.08 g של טריס (בסיס חופשי). מאגר כביסה 150 (WB150): 150 mM הנאסל, 40 mM טריס-HCl pH 8.0 (RT), 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ”מ EtSH. להכין WB150 כמתואר עבור B250 (2.1.1) אבל עם 3.59 g של טריס-HCl, 2.08 g של טריס (בסיס חופשי), ו 8.77 g של הנאל. TEV מאגר שיווציה (TEV): 150 מ”מ היאl, 40 mM טריס-HCl pH 8.0 (RT), 0.5 mM EDTA, 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ”מ EtSH. זהה WB150 אבל להוסיף EDTA ל 0.5 מ”מ ריכוז סופי. מאגר מחשוף TEV (TCB): 150 מ”מ, 40 mM טריס-HCl pH 8.0 (RT), 0.5 mM EDTA, 0.1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) גליצרול, 5 מ”מ EtSH. להכין כמתואר בשלב 2.1.1 עם 3.59 g של טריס-HCl, 2.08 g של טריס (בסיס חופשי), ו 8.77 g של נרוג ולהוסיף 100 mL של גליצרול לפני התאמת נפח ל 1 L. 50 × פרוטאז מעכבי קוקטייל: לפזר 1 טבליה של קוקטייל זמין מסחרית של מעכבי פרוטאז ב 1 מ ל של מים וחנות ב-20 ° c. TBS-T: 50 mM טריס-HCl pH 7.6 (RT), 0.9% (w/v) הנאל, 0.1% (v/v) polysorbate 20. היכונו כמתואר בשלב 2.1.1. השתמש 6.06 g של Tris-HCl, 1.40 g של טריס (בסיס חופשי), 9 גרם של הנאל, ו 1 מ ל של polysorbate 20. 5 × LSB (Laemmli מאגר לדוגמה): 315 mM טריס-HCl pH 6.8 (RT), 25% (v/v) EtSH, 50% (v/v) גליצרול, 10% (w/v) SDS, 0.05% (w/v) ברומאופנול כחול. הכנת תמצית חלבון להוסיף 1.5 g של ליאופ, מייסיליה וכדור שיוף לצנצנת שחיקה של טחנת כדור.הערה: עשוי לשמש גם מיסיליה טרייה. כאשר עושה זאת, יבש תפטיר ביסודיות ככל האפשר לפני הקפאה ולוודא precool הצנצנות לטחינת בחנקן נוזלי לטחינת מייסיליה טרי. לטחון את מייסיליה לאבקה. ב -25 הרץ בשביל 30הערה: במקרים שבהם לא ניתן להשתמש במכונת שיוף, יש לטחון את מיסיליה לאבקה באמצעות מרגמה ומכתש, כפי שמתואר בידי בייראם ואח ‘. . שתיים עשרה העבר אבקה mycelial לשפופרת צנטריפוגה 15 מ ל. להטות את צינורית צנטריפוגה כולל הקרקע תפטיר כדי לאפשר ערבוב הבא של תפטיר עם מאגר. הוסף 6 מ ל של קרח קר B250 כולל 1 × פרוטאז מעכב הקוקטייל לגרם של אבקת mycelial ולהתמזג עם מרית קטנה עד השלמות הגון להוציא את התמצית גולמי מושגת. כשמשתמשים במיסיליה הטרייה, התייחס לבייראם ואח ‘. 12 כדי להשיג את ביומסה הנכון ליחס מאגר החילוץ. . תשאיר את השפופרת על הקרח למשך 5 דקות מניחים את הצינור ואת צינור האיזון לתוך צנטריפוגה ו ספין ב 40,000 × g עבור ≥ 20 דקות ב 4 ° c. ביצוע הequiציה של שרף IgG (שלב 2.3) במהלך צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, להסיר 10 μL של supernatant עבור ניתוח SDS-PAGE. מניחים את המדגם לתוך צינור 1.5 mL המכיל 40 μL של מים ו12.5 μL של 5 × LSB; המכונה “Ex” באיור 1. הסר בזהירות את הסופרנטנט (ניקוי ליפוסט) באמצעות פיפטה סרוולוגית והעבר אל העמודה המכילה את חרוזי IgG הניתנים לשימוש (שלב 2.3) והתקרב בחוזקה באמצעות כובע הסיום המסופק. שיווציה של שרף IgG (שבוצעה במהלך שלב 2.2.7) הכן 10 mL כרומטוגרפיה חד פעמי העמודה pipet 300 μL של היטב-מושעה שרף IgG (50% ליטר) לתוך העמודה. ממלאים את העמודה 10 mL עם B250 ולתת לחיץ לזרום דרך כוח הכבידה. הוסף 1 מ ל של B250 כולל קוקטייל 1 × פרוטאז מעכבי ולתת לזרום. חבר את החלק התחתון של העמודה. טיהור אצווה של הקשה מתויגים HDAC מודטה את העמודה כרומטוגרפיה המכילה את החרוזים מעורפלת ואת ליפוסט נקי משלב 2.2.9 על מיקסר רוטרי ב 10 סל ד ב 4 ° צ’ עבור 2 – 4 h. לאחר כריכת האצווה, הסר את המכסה ופתח את העמודה בתחתית כדי לאסוף את הזרימה. קח דוגמה לניתוח SDS-PAGE כמתואר בשלב 2.2.8; מכונה “FT” באיור 1. שטוף חרוזים עם 10 מ ל של WB250. ראשית, השתמש 1 mL של מאגר כדי להסיר חרוזים לכודים מתוך כובע הטור באמצעות פיטאור ולהעביר את ההשעיה הזאת סומק אחד על שרף התיישבו כדי לאפשר השעיה של החרוזים. לאחר מכן, מלא את העמודה למעלה, סגור באמצעות אות מחסנית והתחבר למשאבה פריסטטית. כוונן קצב זרימה של כ-1 – 5 מ”ל/min. מנע משרף להתייבש. חזור על שלב 2.4.4 שלוש פעמים עבור מספר כולל של ארבעה שוטפים עם WB250. שטוף חרוזים שלוש פעמים עם 10 מ ל של TEB כמתואר בשלב 2.4.4. סגור את העמודה כרומטוגרפיה בחלק התחתון, להשעות את החרוזים IgG מחדש 1 מ ל של TCB, ולהוסיף 20 μl של 50 × פרוטאז מעכב הקוקטייל, כמו גם 10 ΜL של tev (~ 1 מ”ג/mL מלאי, S219V מוטציה variant המיוצר ב-house). Cap את הטור ואת הדגירה על מיקסר רוטרי ב 10 סל ד ב 4 ° c לילה כדי elute מכלולי חלבונים המאוגדים דרך HDAC המתויג.הערה: לחלופין, בצע תקציר TEV בטמפרטורה גבוהה (16 – 25 ° c), אשר מפחית את זמן התגובה, לעומת זאת, מעלה את הסיכון לירידה בחלבון. ביום למחרת לפתוח את הטור ולאסוף את האלוטה בשפופרת צנטריפוגה 2 מ ל. השתמש 0.7 mL של TCB להסיר חרוזים מן הכיפה ולשטוף את הקיר של הטור. מניחים את העמודה על הצינור הפתוח 2 מ”ל מהשלב הקודם שהוא עצמו ממוקם בתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL. להעביר את ההרכבה לתוך צנטריפוגה השולחן העליון ספין ב 300 × g עבור 2 דקות. . זה הדבר הנכון לעשותהערה: בעת ביצוע טיהור של אהדה דו-מושביים, השתמש ב-TEV כקלט לשלב האהדה של הקלמודוללין. אתה יכול גם לפצל את TEV להתחמק ולהשתמש בחלק אחד לקביעת פעילות HDAC ואת החלק השני כדי להשלים את הטיהור ברז. הסרת 50 μL מ-TEV משחרלי ולהוסיף 12.5 μL של 5 × LSB עבור SDS-PAGE (המכונה “TE” באיורים 1 ו-2) ולשמור על שארית שנותר על הקרח. כדי להעריך את היעילות של הימנעות פרוטאז, להוסיף 2 מ ל של 5% (v/v) חומצה אצטית ומטה ב RT עבור 5 דקות. שוב, השתמש ב-mL הראשון כדי להשעות את שרף. לאסוף את החומצה משחרל ושוב לקחת 50 μL לדוגמה ולהוסיף 12.5 μL של 5 × LSB (המכונה “AE” באיור 1). LSB יהפוך צהוב כאשר יתווסף לפתרון החומצי. כדי לנטרל את החומצה, להוסיף 10 M NaOH בשלבים של 1 μL ומערבבים היטב עד שהצבע משתנה לכחול שוב. מחדש את שרף IgG עם TBS-T כדי לנטרל את החומצה. לאחסן את השרף ב-TBS-T/20% (v/v) אתנול ב 4 ° צ’ לשימוש חוזר עם אותו חלבון מתויג. אחסנה של שברי הימנעות לאחר הימנעות לתוך ~ 100 μL שברים, כדי למנוע מחזורים להפשיר הקפאה מרובים. מקפיאים בחנקן נוזלי ושומרים ב-80 ° c.הערה: דוגמאות שאוחסנו באופן זה יהיו יציבות במשך חודשים מבלי לאבד פעילות אנזימטית. 3. ניתוח טיהור באמצעות SDS-עמוד ומערב מערבי השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים ליציקת SDS-פוליאקרילאמיד ג’ל או להשתמש בעזרת ג’ל לשימוש13. דגימות הספרות מהחלק הקודם ב 95 ° c עבור 5 דקות, צנטריפוגה ב ≥ 15,000 × g עבור 5 דקות, ו לטעון על 12% ג ‘ לים. אמצעי אחסון מומלצים לטעינה מקבלים במקרא של איור 1. אלקטרופורזה הדגימות ב 1 × טריס-גליצין SDS-עמוד מאגר פועל בשעה 180 V קבוע עבור 60 – 70 דקות, עד הסמן הכחול ברומרופנול של מאגר הטעינה של SDS-PAGE מתחיל לנדוד מתוך ג’ל. השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים עבור כתמים כסף של ג ‘ לים. לדוגמה, השתמש בפרוטוקול של בלום ואח ‘. 198714 התואם גם לניתוח MS. השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים עבור כתמים מערביים15. עבור הדור של תוצאות הנציגה להלן, נעשה שימוש במערכת מסחרית זמינה. בדיקת הכלים עם חלבון מסחרית נגד calmodulin כריכה (anti-cbp) הנוגדן ב 5% (w/v) אבקת חלב ב-TBS-T ב 4 ° c הלילה.הערה: הנוגדן נגד CBP מופנה לחלק של תג הקש עדיין נוכח לאחר מחשוף TEV. השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים לאיתור ופיתוח של blots. לדוגמה, אנטי ארנבת IgG-אלקליין פוספספטאז המשלים ו BCIP/NBT פיתוח צבע המצע שימשו עבור הדור של תוצאות הנציג להלן. 4. מימוש בשיטת דפורקלז באמצעות מבחנה באמצעות מתורבת (3ש ח) מתויג עוף (מותאם Trojer et al. 2003)4 עיין בפרוטוקול של Kölle ואח ‘ . 199816 לקראת הכנת העוף [3ה] אצטט-התווית של העופות. לכל מקום בתנאי מיקום שלושה 1.5 מ”ל צינורות צנטריפוגה על קרח עבור מדידות בטרילקטים. הכן גם שלוש שפופרות לבקרת רקע של מאגר בלבד. שים 25 μL של WB150 לתוך צינור כל ולהוסיף 25 μL של TEV להתחמק משלב 2.4.11 ולשמור על קרח. מחממים אינקובטור צינור ל -25 ° c. השתמש במרווחי זמן של 15 (להפסיק לצפות) עבור תוספת של 10 μl של התווית יסטוניים [1.5 mg/mL] לכל צינור. לפני תחילת השיטת, לקחת את 10 μL של [3ח] אצטט מתויג עוף האבנים ולהתחיל לצפות לעצור. חמש שניות לאחר ההתחלה, להוסיף את האבנים המסומנות, לסגור את הצינור בחוזקה, מערבולת, ולשים אותו לתוך החממה. השתמש במרווחי זמן של 15 s עבור תוספת של 10 μL של התוויות המסומנות והמשך כמתואר בשלב הקודם. אחרי 60 דקות דגירה להוסיף 50 μL של פתרון להפסיק (1 M HCl/0.4 M חומצה אצטית) לכל צינור במרווחי זמן של 15; ערבולת מיידית לאחר הוספת התמיסה החומצית, השילוב הקבוע הוא יציב וניתן לשמור אותו ב-RT עד לשלב הבא. הוסף 800 μL של אתיל אצטט לכל צינור כדי לחלץ את שוחרר [3H] חומצה אצטית. סגור היטב את הצינורות ומערבולת כל צינור עבור 5 s. מניחים את הצינור לתוך מיקרוצנטריפוגה ו ספין ב 10,000 × g עבור 10 דקות ב-RT. בינתיים, הכינו בקבוקון אחד לדגימת שיטת הדגימה, והוסיפו 3 מ ל של קוקטייל של בדיקת המים לדגימות הידרופובי. לאחר צנטריפוגה (שלב 2.12), בזהירות להעביר 600 μL של השלב האורגני העליון לתוך הצינורות מוכנים של שפופרות ולסגור את הצינורות בחוזקה. מדוד את הרדיואקטיביות המתאימה לפעילות ה-HDAC בתוך מונה.