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生物工程

Sin células proteína expresión usando el crecimiento rápido de bacteria Vibrio natriegens

Published: March 14, 2019
doi:
10.3791/59495
, , ,
1Department of Genetics,Harvard Medical School, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering

Summary

Sistemas de expresión libre son herramientas poderosas y costo-eficiente para la síntesis de alto rendimiento y detección de proteínas importantes. Aquí, describimos la preparación del sistema de expresión de proteínas libres de células con Vibrio natriegens para la producción de la proteína rápida usando la DNA del plasmid DNA linear y plantilla del mRNA.

Abstract

La bacteria Marina Vibrio natriegens ha atraído considerable atención como un huésped microbiano emergente de biotecnología debido a su rápido crecimiento. Se describe un protocolo general para la preparación de V. natriegens extractos crudos de la célula usando equipo común de laboratorio. Este alto rendimiento protocolo ha sido específicamente optimizada para la accesibilidad del usuario y un costo reducido. Síntesis de proteínas libres de células (PFC) puede realizarse en pequeña escala 10 μL por lotes las reacciones en un formato de 96 o 384 pocillos y reproducible produce concentraciones de > 260 μg/mL super carpeta GFP (sfGFP) 3 h. general celular crudo extracto, preparación y PFC se logra en días completos de 1−2 por un solo usuario. Este protocolo puede integrarse fácilmente en tuberías de síntesis de proteína existente para facilitar avances en bio-producción y aplicaciones de la biología sintética.

Introduction

Síntesis de proteínas libres de células es un método rentable y versátil para la expresión de valiosas proteínas o péptidos1,2,3,4. Históricamente, la síntesis de proteínas libres de células se ha realizado utilizando sistemas de expresión de Escherichia coli ; sin embargo, ha habido un reciente aumento en el uso de alternativa, no modelo organismos con nuevas propiedades como chasis para expresión libre5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismos con perfiles metabólicos únicos son principales candidatos como alternativas a los sistemas libres de células de e. coli . Por ejemplo, la bacteria Marina que Vibrio natriegens es el de mayor crecimiento de todos los organismos conocidos con un observado la duplicación de tiempo de menos de 10 min13. Esto ha atraído V. natriegens considerable atención como un huésped microbiano emergente de investigación y biotecnología14,15,16,17,18. Dado que la rápida tasa de crecimiento del V. natriegens ha estado vinculada a altos índices de síntesis de la proteína y eficiencia metabólica19,20,21, aprovechando la maquinaria celular para celular gratis síntesis puede ampliar considerablemente el conjunto de herramientas para la producción de proteínas rápida y alto rendimiento.

Recientemente, una célula libre V. natriegens sistema de expresión se ha demostrado que es capaz de producir super carpeta GFP (sfGFP) a concentraciones de > 260 μg/mL en 3 h con un promotor T7 del9. El objetivo general de desarrollar este método fue proporcionar a los usuarios con un sistema de expresión de proteína altamente accesible, rentable, reproducible y alto rendimiento libres de células que puede prepararse con equipo de laboratorio común en un corto período de tiempo. Este protocolo utiliza cultivos de 1 L en frascos de shake, lisis celular por sonicación de impulsos y reacciones en pequeña escala por lotes en un formato de 96 o 384 pocillos para maximizar la paralelización y rendimiento de detección. Una expresión de la proteína larga y sostenida es posible por la suplementación del ácido 3-bisfosfoglicérico (3-PGA) como una fuente de energía8,22,23. Sobre con éxito terminar este protocolo, un usuario tendrá la capacidad para expresar una proteína deseada o extraiga el conjunto de las proteínas en un formato libre utilizando V. natriegens crudo celular.

A partir de un stock de glicerol, V. natriegens extractos crudos de la célula están preparados de células cosechadas en densidad óptica a 600 nm (OD600) de 1.0. Una cultura de 1 L produce aproximadamente 2−3 mL de extracto, que es suficiente para más de 800 reacciones acelulares en el extracto crudo de la célula de 25%. Las proteínas se pueden expresar usando la DNA del plasmid, ADN lineal o plantilla del mRNA; sin embargo, degradación de plantilla de ADN lineal por nucleasas endógenas sigue siendo un gran inconveniente cuando se utiliza el tipo salvaje V. natriegens sin células sistema9. A partir de culturas V. natriegens , proteína utilizable para aplicaciones posteriores se logra por un solo usuario en días completos de 1−2.

Protocol

1. preparación de V. natriegens de crudo extractos celulares, cultivo bacteriano Preparar el V. natriegens crecimiento bacteriano medios LB-V2 según tabla 1. Esterilice en autoclave los los medios de crecimiento. Permitir que los medios de comunicación llegar a la temperatura ambiente (RT). Almacenar el exceso de medio a TA.PRECAUCIÓN: Usar equipo de protección personal apropiado (EPP) y consultar las instrucciones específicas del laboratorio al operar autoclave. Utilice un stock de glicerol del tipo salvaje V. natriegens para inocular 3 mL de medio LB-V2. Crecen durante la noche a 30 ° C agitando a 225 rpm. 1 mL del cultivo durante la noche la colada por centrifugación a 10.600 x g en una centrífuga de sobremesa 1 min aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet resultante y resuspender en 1 mL de medio fresco de la LB-V2. En un autoclave 4 L desconcertado matraz Erlenmeyer con tapa estéril, añadir 1 L de fresco LB-V2 crecimiento los medios de comunicación. Inocular con 1 mL de lavado cultura durante la noche (1:1, 000 relación de dilución). Crece cultura a 30 ° C agitando a 225 rpm.Nota: V. natriegens culturas se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo manteniendo la relación de dilución de 1:1,000. Por ejemplo, Añadir 250 μL de cultivo lavado durante la noche a 250 mL de medio de crecimiento de LB-V2 fresco en 2 L desconcertado matraz Erlenmeyer con tapa estéril. Monitor OD600 usando un espectrofotómetro de cultura. Cuando el cultivo alcanza OD600 = 1,0 ± 0.2, cosecha cultura mediante centrifugación a 3.500 x g por 20 min a 4 ° C. Coloque la pelotilla en hielo.Nota: V. natriegens crece rápidamente, vigilancia estrecha de la cultura es necesario. Crecimiento a OD600 = 1.0 debe tomar aproximadamente 1.5−2 h en la relación de dilución de 1:1,000. Aspirar el sobrenadante y almacenar inmediatamente el pellet bacteriano resultante a-80 ° C o proceder directamente a la célula lysis descrito en la sección 2.Nota: Este paso es un buen punto; sin embargo, se recomienda que la pelotilla procesar inmediatamente o dentro de 1−2 días para obtener mejores resultados. 2. preparación de V. natriegens de crudo extrae células, lisis celular Preparar el tampón de lisis S30 según tabla 1 en estéril desionizada (DI) y ajustar el pH a 7,7 utilizando ácido acético glacial.PRECAUCIÓN: Ácido acético glacial se manipularán PPE adecuado cuando se ajusta el pH. Tampón de lisis S30 fresco a aproximadamente 4 ° C en un refrigerador o en hielo antes de iniciar el procedimiento de lisis celular.Nota: Para un rápido enfriamiento, lysis buffer puede colocarse a-20 ° C. No permitir que el tampón se congele. Coloque el pellet celular en hielo 10−20 min o hasta completamente descongelada. Vuelva a suspender los pellets resultantes de la misma cultura de 1 L con 10 mL de tampón de lisis S30 frío, a continuación, transfiera la suspensión a un tubo de 50 mL. Si los pellets no son congelados en el congelador a-80 ° C en paso 1.6, se proceder directamente a la resuspensión.Nota: Aumentar el volumen de tampón de lisis S30 solía suspender inicialmente pellets según sea necesario. Suspensión de centrifugar a 3.500 x g por 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet. Lavar el precipitado una segunda vez con 10 mL de tampón de lisis S30 frío. Coloque la pelotilla en hielo. En una habitación fría, Añadir 500 μL de tampón de lisis de frío S30 para el sedimento en el tubo de 50 mL. Usando una punta de pipeta ancha, Resuspender el precipitado y transferir cuidadosamente la suspensión de toda pelotilla a un tubo de 2 mL.Nota: Si un ancho agujero pipeta no está disponible, utilice un par de tijeras para cortar el extremo de la punta de una pipeta de 1 mL para aumentar el agujero para la transferencia de la pelotilla. Transfiera tanto sedimento como sea posible sin aumentar significativamente el volumen; sin embargo, el sedimento debe ser resuspendió en suficiente líquido para ser sonicada, indicado por una suspensión homogénea en el tubo de 2 mL. No permita que rebose el tubo de 2 mL. La suspensión no excederá de 1.5 mL; dividir en múltiples tubos si es necesario. Mantenga el precipitado de células en el hielo y trabajar en una habitación fría. Llene un vaso de precipitados de 600 mL con hielo y colocar un soporte de tubo de 2 mL en la parte superior del hielo.Nota: Es útil colocar el soporte del tubo cerca de la parte del vaso, así la suspensión de la pelotilla será visible en el hielo para supervisar el progreso de la sonicación (ver figura 1). Vórtice suspendido pellet en tubo de 2 mL para homogeneizar las células, flick tubos para eliminar cualquier célula en la parte inferior de la tapa y coloque un soporte de tubo con tapa abierta. Inferior punta sonicador en la suspensión para que sea justo debajo de la superficie del líquido. Preparar el montaje de sonicación como se muestra en la figura 2 utilizando un sonicador y probe con un diámetro de punta de ⅛ pulgadas. Los siguientes ajustes en el control del sonicador de entrada: 20 kHz de frecuencia y amplitud de 50%, pulso en el tiempo: 10 s, impulso OFF hora: 60 s. Ejecutar el protocolo de sonicación de pulso durante tres ciclos. Si el volumen total de la suspensión de la pelotilla es > 500 μL, ejecute el protocolo de sonicación de pulso seis veces.Nota: En general, 3−6 pulsos son suficientes para lyse V. natriegens pellets; pulsos de adicionales pueden ser necesarios según sonicador. Durante la sonicación, utilice la plataforma de la perilla de ajuste para mover la sonda hacia arriba y hacia abajo a lyse cualquier pelotilla que puede haber colocado en la parte inferior del tubo. El tubo se puede quitar del soporte y brevemente agitó para volver a homogeneizar la suspensión entre pulsos. Ver discusión a continuación para obtener la consistencia deseada de células sonicadas.PRECAUCIÓN: Usar protección auditiva adecuada cuando el sonicador está activo. Tras sonicación, celular crudo centrífuga Extraiga a 16.000 x g por 30−45 min a 4 ° C o hasta que el lisado es libre de cualquier escombro celular como se muestra en la figura 3. En un cuarto frío, alícuotas de 50 μL de los sobrenadantes resultantes a nuevos tubos de 2 mL sin perturbar el pellet.Nota: cualquier residuo que se transfiere accidentalmente en los nuevos tubos de 2 mL reducirá drásticamente la capacidad del extracto para alto rendimiento síntesis de proteína. Opcionalmente, situado a un lado Extraiga 10 μL de células para la cuantificación de la proteína de lisis posterior en un separado 2 mL del tubo (ver paso siguiente 2.13). Flash freeze extractos crudos de la célula mediante la colocación de tubos en un soporte de tubo con una cadena que adjunto como se muestra en la figura 4. Sumerja los tubos en un Dewar con nitrógeno líquido y colocar inmediatamente en un congelador a-80 ° C hasta su uso.PRECAUCIÓN: Use PPE apropiado para el manejo de nitrógeno líquido como bata de laboratorio, gafas de seguridad, protector facial, delantal cryogen y guantes. Opcionalmente, cuantificar la proteína total de la célula con 10 μL fijado aparte paso 2.11.1 por diluir la muestra 1: 100, 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el uso de cualquier ensayo de cuantificación de proteínas totales estándar como ensayo de Bradford, ácido bicinchoninic lisada ensayo (BCA), etcetera. 3. preparación de componentes de la reacción sin células Componentes de la reacción general Preparar las acciones de trabajo de glutamato de magnesio y de K-glutamato en tubos de 50 mL con agua estéril DI a concentraciones de 100 mM y 2000 mM, respectivamente. Preparar una bolsa de trabajo de 50% (p/v) de polietilenglicol (PEG)-8000 agregando 100 mL de DI estéril agua a un vaso de precipitados de 250 mL. Coloque un pequeño agitador magnético en el vaso. Pesar 50 g de PEG 8000 y añadir a 100 mL de agua en el vaso. Coloque el vaso en un conjunto de placa de agitación caliente a 100 ° C y mezclar a 250 rpm hasta PEG-8000 en solución. Permitir que la mezcla líquida PEG-8000 enfriar antes de transferir a tubos de 50 mL. Mezcla principal de la solución energética Preparar una solución de 5 M de KOH mediante la adición de 140 g de pellets KOH en 500 mL de agua desionizada estéril.PRECAUCIÓN: Preparar esta solución en una campana química y use PPE al manejo de bases fuertes. La solución se calienta así la tapa debe estar floja para evitar la acumulación de presión. Deje que la solución KOH a RT antes de usar. Preparar un buffer HEPES-KOH de 1750 mM agregando 20,85 g de HEPES a una botella de 100 mL. Lentamente agregue agua desionizada estéril hasta que el volumen llegue a 40 mL. Botella de vórtice para disolver el HEPES. Utilizar una solución KOH de 5 M para ajustar el pH a 8.0 y luego llevar el volumen de la solución a 50 mL.PRECAUCIÓN: KOH se manipularán PPE adecuado cuando se ajusta el pH. Prepare los 10 restantes x stock componentes de mezcla principal de energía en las concentraciones indicadas en la tabla 2 en agua desionizada estéril y colocar cada acción en el hielo. Descongele las reservas de ATP, GTP, CTP y UTP de 100 mM en RT y el lugar en el hielo.Nota: Un Termomezcladores a 37 ° C y 350 rpm pueden utilizarse para disolver los reactivos en solución si es necesario. No sobrecalentar o deje reactivos en el Termomezcladores para un período prolongado de tiempo. En un tubo de 15 mL, añadir cada componente de mezcla principal de solución de energía de acuerdo a la orden y el volumen especificado en la tabla 2. Vórtice de la solución después de agrega cada componente. Esto hará que 5 mL 10 x combinación principal de la solución energética. Dividir los 10 x combinación principal de solución energética en 200 alícuotas μL en tubos de 2 mL. Flash freeze cada alícuota como se realizó en el paso 2.12. Inmediatamente colocarlas en el congelador de-80 ° C hasta su uso. Mezcla principal aminoácido Para preparar fresca 4 x mezcla principal aminoácido, comenzar descongelación cada acción del aminoácido en el RT y luego colocando cada uno en el hielo. Debe utilizarse un vórtice o Termomezcladores de 37 ° C y 350 rpm para todas las reservas de aminoácidos se disuelven completamente.Nota: Cisteína no puede disolverse completamente; puede ser agregado a la mezcla principal aminoácido como una suspensión. No sobrecalentar o deje reactivos en el Termomezcladores para un período prolongado de tiempo. En un tubo de 15 mL, añadir el volumen adecuado de aminoácidos a agua desionizada estéril para que la concentración final de cada uno es de 8 mM en el siguiente orden: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, su, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU y CYS. Después de agregar cada aminoácido, vórtice maestro agite la solución. 2,4 mL de mezcla principal aminoácido componen los volúmenes enumerados en la tabla 2 . Dividir el 4 x del aminoácido principal mezcla 200 alícuotas μL en tubos de 2 mL. Flash freeze cada alícuota como se realizó en el paso 2.12. Coloque inmediatamente en un congelador a-80 ° C hasta su uso. Producción de la plantilla de la DNA de plásmido de reacción-listoNota: Expresión de la proteína libre en este sistema se ha optimizado con el vector de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) super carpeta T7-pJL1-sfGFP (Tabla de materiales). Se recomienda utilizar este plásmido como control de eficiencia de la reacción libre y la columna vertebral de pJL1 para la clonación y expresión de otras secuencias de la proteína. Otras plantillas de la DNA de plásmido se pueden utilizar; sin embargo, es importante tener en cuenta que la transcripción es controlada por una secuencia de promotor de T7 y la presencia de la T7 ARN polimerasa. A continuación se describe un protocolo simple para la producción a gran escala de cualquier plantilla de la DNA de plásmido de transformadas de e. coli . Purificar el vector deseado usando un kit de purificación de plásmidos según instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).Nota: Concentración de la plantilla de la DNA de plásmido tanto como sea posible se recomienda para conocer las limitaciones de volumen apretado de la reacción sin células. En general, tienen como objetivo una acción de trabajo de 750−1500 ng/μL. Producción de reacción preparada plantilla de mRNANota: Esta sección es opcional. Expresión de la proteína ha sido probada usando mRNA plantilla generado a partir de la transcripción in vitro del plásmido T7-pJL1-sfGFP por la lista T7 ARN polimerasa (Tabla de materiales). Preparar la plantilla del mRNA de plásmido DNA codificando la proteína de interés usando los componentes de la reacción de transcripción in vitro en la tabla 3. Incubar las reacciones por 1 h a 37 ° C en un termociclador.Nota: Se recomienda realizar 8−10x de estas reacciones en paralelo para generar suficiente material. Todas las reacciones de transcripción de la piscina. Purificar con un kit de purificación y concentrador de mRNA según instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). Eluir la plantilla del mRNA en agua desionizada estéril. Guardar plantilla del mRNA a-80 ° C hasta su uso. 4. realizar sin células proteína Eexpression reacciones utilizando V. natriegens crudo Extracto Expresión de la proteína sin células utilizando plásmidos o plantilla de la DNA linear Retire el congelador de-80 ° C, 10 x combinación principal de la solución energética y 4 x del aminoácido principal mezcla alícuotas descongelar a temperatura ambiente y coloque en hielo. Retire la T7 ARN polimerasa y las poblaciones de inhibidor de la Rnasa del congelador de-20 ° C y coloque en hielo. Descongele la plantilla de la DNA en RT y el lugar en el hielo. Preparar una mezcla maestra de reacción sin células según tabla 4 agregando cada componente en el siguiente orden a un tubo de 2 mL en hielo: aminoácido principal mezcla combinación principal de la solución energética, glutamato de magnesio, K-glutamato, plantilla de la DNA, PEG-8000, T7 ARN polimerasa y Rnasa inhibidor de la. Mueva suavemente el tubo después de cada adición a la mezcla principal.Nota: Si plantilla lineal debe ser utilizado para la expresión de la proteína sin células, añadir 5−10x más material en comparación con la plantilla de plásmido para obtener apreciables rendimientos de proteína. Quitar V. natriegens crudo celular lysate preparado en el paso 2.12 de los congeladores de-80 ° C y el lugar de hielo para 10−20 min hasta descongelado. Añadir el volumen adecuado celular crudo extracto a la mezcla principal de reacción libre según tabla 4 y mezclar suavemente agitando o pipeteando arriba y abajo. Expresión de la proteína sin células de punto final con el termociclador Pipetee 10 μL de la mezcla principal de reacción sin células en la parte inferior de una placa PCR de 96 o 384 pocillos. Entre cada transferencia a la placa de la polimerización en cadena, mezcla el master por sacudiendo suavemente el tubo.Nota: Mezcla principal reacción libres de células se debe mezclar bien en todo momento para maximizar la reproducibilidad de la reacción y expresión de la proteína libre en todas las muestras. Centrifugar brevemente la placa a 1.000 x g durante 10 s a cualquier mezcla de maestro que puede haber se atasque en los lados de los pocillos. Sellar los pozos con un pegamento de la placa para evitar la evaporación y luego coloque la placa PCR en un termociclador situado a 26 ° C con tapa calentada a 105 ° C.Nota: La distribución uniforme del calor y la tapa caliente de un termociclador mejora grandemente el rendimiento de expresión de la proteína. Incubar las reacciones sin células para un mínimo de 3 h. Después de la incubación, expresa las proteínas pueden ser purificadas cuantificadas y utilizadas para procesos posteriores.Nota: Proteínas expresadas pueden cuantificarse directamente en la reacción sin células, utilizando un método de elección del usuario. Por ejemplo, proteínas fluorescentes pueden ser cuantificadas usando una curva estándar externa o radiactividad puede medirse si se usa un aminoácido radiactivo en la reacción sin células. Espectroscopía UV-visible o análisis de proteína total generalmente no se recomiendan para medir directamente la producción de proteínas en reacciones sin células sin una purificación inicial. Por otra parte, supervisar cinética de expresión de proteínas libres de células usando un lector de placas. Pipetee 10 μL de la mezcla principal reacción sin células en la parte inferior de una placa de ensayo de 384-pozo negro con fondos de cristal. Mantenga la placa de ensayo sobre hielo o trabajar en una habitación fría añadiendo a la mezcla principal para asegurar que se obtiene el perfil cinético completo. Sellar los pozos con un adhesivo transparente de la placa para evitar la evaporación y luego colocar la placa de ensayo en un lector de placa situado a 26 ° C. Incubar las reacciones sin células de 3−6 h mientras las longitudes de onda de excitación/emisión fluorescente apropiada correspondiente a la proteína expresada. Supervisar por ejemplo, en Ex / Em = 485 nm nm/528 para sfGFP. Expresión de la proteína sin células usando mRNA plantilla Plantilla de mRNA de deshielo preparada en el paso 3.5.2 en RT y el lugar en el hielo. Realizar paso 4.1.1 al paso 4.1.6 anteriormente especificado para lineal o utilizando la tabla 4 para preparar una mezcla maestra de reacción alternativos libres de células para la plantilla del mRNA de la plantilla de la DNA de plásmido. 5. calibración de V. natriegens sin células reacciones con sfGFP Nota: Esta sección es opcional. La concentración de iones de reacción óptimo libre de células puede variar ligeramente para cada preparación de extracto crudo basado en las condiciones para la lisis celular. Considerar la realización del reacción libre opcional ion calibración protocolo que se describe a continuación con sfGFP si los rendimientos de la reacción son significativamente más bajos de lo esperado (concentraciones < 1.0 μg/mL). Preparar el Mg2 + y soluciones de calibración de ion K+ como se especifica en la tabla 5 en agua estéril DI del glutamato de magnesio de 100 mM y 2.000 mM K-glutamato acción preparada en el paso 3.1.1. Lugar de soluciones de calibración en el hielo hasta que se necesite. Siguiendo el mapa de calibración en el cuadro 6, Pipetear 1 μL del glutamato de magnesio y 2 μL de soluciones de calibración de ion K-glutamato en los pocillos adecuados en una placa PCR de 384 pocillos. El orden de las operaciones de este paso es el siguiente: solución de calibración de pipeta el glutamato Mg ion en la parte inferior de cada uno bien seguido por la solución de calibración de iones de K-glutamato en el lado del bien sin tocar el líquido ya está presente en los pozos. Sellar los pozos mediante la colocación de un adhesivo encima de la placa para evitar la evaporación mientras se prepara la mezcla principal de calibración sin células de reacción. Golpear suavemente la placa de 384 pocillos para mezclar las soluciones de calibración de glutamato Mg y K.Nota: Una pipeta de repetición se recomienda para completar este paso, reproducible y rápida. Preparar la mezcla principal de reacción sin células de calibración tal como se especifica en la tabla 5 con plantilla de DNA de plásmido T7-pJL1-sfGFP en un tubo de 2 mL. Añadir cada componente en el siguiente orden a la mezcla principal: aminoácido principal mezcla combinación principal de la solución energética, plantilla de la DNA T7-pJL1-sfGFP, PEG-8000, T7 ARN polimerasa e inhibidor de la Rnasa. Flick suavemente el tubo para mezclar después de cada adición de componentes.Nota: No agregue Mg2 + o K+ a la calibración de mezcla principal sin células. Retire el adhesivo de la placa. Cuidadosamente pipetee 7 μL de la mezcla principal de reacción sin células de calibración a los lados de los pocillos sin tocar la solución de calibración de ion Mixto ya presente en los pozos. Sellar los pozos con el adhesivo y golpear suavemente la placa PCR 384 pocillos para mezclar la mezcla sin células principal con la solución de calibración de ion.Nota: Una pipeta de repetición se recomienda para completar este paso, reproducible y rápida. Centrifugar brevemente la placa 1.000 x g durante 10 s a cualquier líquido sin mezclar que puede haber se atasque en los lados de los pocillos. Coloque la placa de 384 pozos en un termociclador situado a 26 ° C con tapa calentada a 105 ° C. Incubar las reacciones sin células de 3 h. Después de la incubación, transferir el contenido de cada pocillo a una placa de ensayo de 384-pozo negro con fondos de cristal con una pipeta multicanal y leer la fluorescencia de sfGFP en Ex / Em = 485 nm/528 nm utilizando un lector de placas para determinar la combinación de la concentración de iones que produce la mayor cantidad de proteína.

Representative Results

El protocolo descrito para la producción de proteína con V. natriegens el sistema de la libre expresión se puede ejecutar en 1−2 días por un único usuario, a partir de la inoculación de la cultura a la proteína disponible para aplicaciones posteriores. Preparación de extractos crudos de la célula y las poblaciones de mix master constituyen una parte importante de este tiempo; sin embargo, una vez preparada, la mayoría a granel reactivos pueden ser almacenada a largo plazo (Tabla 7) y utilizan cuando sea necesario, acortando el tiempo necesario para completar el protocolo. El sistema de expresión describido mejor se utiliza con la plantilla de la DNA de plásmido o mRNA generado por las reacciones de transcripción in vitro. Mientras que DNA lineal también puede ser utilizado como plantilla para la producción de proteínas, produce menor cantidad de proteína. Por ejemplo, en condiciones óptimas reacciones a 26 °C, puede producir una reacción sin células solo 10 μL > 260 μg/mL de sfGFP en 3 horas con 0.3 pmol de plantilla de la DNA de plásmido o una comparable > 125 μg/mL de sfGFP con 14 pmol de transcripción de mRNA (figura 5A B). Sin embargo, 0.3 pmol de ADN lineal produce significativamente menos proteína (< 20 μg/mL). Para cada tipo de plantilla, la mayoría de la proteína se producirá dentro de 1−1.5 h; sin embargo, se recomienda que la reacción se ejecuta por un mínimo de 3 horas. Se determinaron las concentraciones de la reacción celular libre de sfGFP mediante regresión lineal usando una curva estándar de sfGFP purificada medir fluorescencia en Ex / Em = 485 nm/528 nm. El rendimiento de la producción de proteína es afectado significativamente por la concentración de iones de potasio y magnesio (K+ y Mg2 +, respectivamente). Bajo condiciones optimizadas, se encontró que el óptimo Mg2 + y las concentraciones de iones K+ será de 3,5 mM y 80 mM, respectivamente (figura 6A, B). Las desviaciones de las concentraciones de ion óptimo pueden resultar en una capacidad disminuida para el sistema de libre expresión producir proteínas con rendimientos apreciables. Calibración adicional puede ser necesaria si los rendimientos de la reacción son significativamente más bajos de lo esperado. Un protocolo facultativo para la calibración del ion se describe en la sección 5. Esto permite cierta flexibilidad en la compensación por variabilidad de extracto crudo de la célula derivada de las condiciones y equipo de lisis de células individuales. Figura 1: una vista cercana del vaso de precipitados y el tubo de soporte en la plataforma de sonicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: configuración de equipos de sonicación para la preparación de la célula cruda extracto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: una vista del pellet después de la sonicación y centrifugación de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: dip para almacenamiento de información de extracto de congelación Flash. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Resultados de representante para V. natriegens sin células síntesis de la proteína usando tipos de plantilla diferentes. Ensayo de punto final (A) de producción de sfGFP usando concentraciones equimolares de plásmido y plantilla de DNA lineal (0.3 pmol), así como aumento de las concentraciones de plantilla del mRNA. Se determinó la concentración de sfGFP libres de células usando una curva estándar de sfGFP purificada medido en Ex / Em = 485 nm/528 nm después de 180 minutos de incubación a 26 ° C en condiciones de reacción óptimas en 10 volúmenes μL. (B) análisis cinético de la producción de sfGFP usando concentraciones equimolares de plásmido y plantilla de la DNA linear, así como aumento de las concentraciones de plantilla del mRNA. sfGFP las mediciones se realizaron cada 3 minutos en Ex / EM = 485 nm/528 nm durante 180 minutos total de tiempo de incubación en las condiciones de reacción óptimas en 10 volúmenes μL. Para endpoint y ensayos cinéticos, las muestras fueron en blanco corregidos usando reacciones celular libre con todos los componentes excepto la plantilla. Se muestran la media y la desviación estándar (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: resultados del representante para la calibración de la concentración de iones. (A) V. natriegens sin células reacciones fueron complementadas con el aumento de las concentraciones de Mg2 + y se incubaron a 26 ° C durante 180 minutos en 10 reacciones μL. La concentración total de K+ fue de 160 mM para todas Mg2 + las concentraciones. Se determinó la concentración de sfGFP libres de células usando una curva estándar de sfGFP purificada medido en Ex / Em = 485 nm/528 nm. (B) V. natriegens sin células reacciones fueron complementadas con el aumento de las concentraciones de K+ y se incubaron a 26 ° C durante 180 minutos en 10 reacciones μL. La concentración total de Mg2 + fue de 3,5 mM para todas las concentraciones K+ . Para ambas calibraciones, las muestras fueron en blanco corregidos usando reacciones celular libre con todos los componentes excepto la plantilla. Se muestran la media y la desviación estándar (n = 3). Esta figura ha sido modificada de Wiegand et al.9. Reimpreso con permiso de Wiegand, D.J., Lee, H.H., Ostrov, N., de la iglesia, G.M., establecer un libre Vibrio natriegens sistema de expresión. Biología sintética de ACS. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1 Preparación de medios de crecimiento bacteriano LB-V2 Componente Cantidad (g) Concentración final (mM) Volumen final (L) Caldo LB (Miller) 25 1 NaCl 11.69 200 MgCl2 2.20 23.1 KCl 0.31 4.2 Tabla 1 Preparación de Buffer de lisis S30A Componente Cantidad (g) Concentración final (mM) Volumen final (L) Solución de Tris (pH 8.0) – 1 M (mL) * 25 50 0.5 Glutamato de magnesio 2.72 14 K-glutamato 6.10 60 Ditiotreitol (DTT) – 1 M (mL) * 1 2 Tabla 1: reactivos para la preparación de 1 L de medio de crecimiento bacteriano LB-V2 y 0,5 L de tampón de lisis celular S30A. Haga clic aquí para descargar este archivo en Excel.  Preparación de 10 x energía solución Master Mix Componente Concentración común (mM) Concentración final (mM) Cantidad (μL) Volumen final (μL) PH de HEPES-KOH 8 1750 500 1428.57 5000 ATP 100 15 750.00 GTP 100 15 750.00 CTP 100 9 450.00 UTP 100 9 450.00 tRNA de e. coli MRE 600 (mg/mL) * 100 2 100.00 Hidrato de coenzima A 200 2.6 65.00 NAD 200 3.3 82.50 Campamento 650 7.5 57.69 Ácido folínico 100 0,7 35.00 Espermidina 1600 10 31.25 3-PGA 2000 300 750.00 Agua desionizada estéril 49.99 Preparación de 4 x del aminoácido Master Mix Componente Concentración común (mM) Concentración final (mM) Cantidad (μL) Volumen final (μL) ALA 168 8 114.3 2400 ARG 168 8 114.3 ASN 168 8 114.3 ASP 168 8 114.3 GLN 168 8 114.3 GLU 168 8 114.3 GLY 168 8 114.3 suyos 168 8 114.3 IIE 168 8 114.3 LYS 168 8 114.3 SE REUNIÓ 168 8 114.3 PHE 168 8 114.3 PRO 168 8 114.3 SER 168 8 114.3 THR 168 8 114.3 VAL 168 8 114.3 TRP 168 8 114.3 TYR 168 8 114.3 LEU 140 8 137.1 CYS 168 8 114.3 Agua desionizada estéril 91.4 Tabla 2: Reactivos para la preparación de 5 mL 10 x solución energética master mix y 2,4 mL de 4 x mezcla principal aminoácido.    Haga clic aquí para descargar este archivo en Excel. T7 ARN polimerasa en las reacciones de transcripción de Vitro Componente Stock (mM) Concentración final (mM) Reacción de 1 x cantidad (μL) Cantidad (μL) x 50 reacciones 10 x Buffer de reacción RNAPol 1.00 50 ATP 100 0.5 0.10 5 GTP 100 0.5 0.10 5 CTP 100 0.5 0.10 5 UTP 100 0.5 0.10 5 Plantilla de ADN (ng/μL) * 1000 500 0.50 25 T7 polimerasa del RNA 200 2.6 2.00 100 Inhibidor de Rnasa, murino 200 3.3 0.50 25 Agua desionizada estéril 15.60 780 Volumen (μL) de la reacción: 20 Tabla 3: componentes de transcripción In vitro para la generación de mRNA.    Haga clic aquí para descargar este archivo en Excel. Sin células reacción Master Mix Componente Concentración común (mM) Concentración final (mM) Reacción de 1 x cantidad (μL) Cantidad (μL) x 50 reacciones Extracto (%) * 25 2.50 125.00 Glutamato de magnesio 100 3.5 0.35 17.50 K-glutamato 2000 80 0.40 20.00 4 x aminoácidos Master Mix 8.0 2 2.50 125.00 10 x energía solución Master Mix 1.00 50.00 Plásmido de ADN (ng/μL) * 1000 500 0.50 25.00 50% PEG-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00 T7 polimerasa del RNA 1.00 50.00 Inhibidor de Rnasa, murino 0.10 5.00 Agua desionizada estéril 1.25 62.50 Volumen (μL) de la reacción: 10 Alternativa libre reacción Master Mix para plantilla del mRNA Componente Concentración común (mM) Concentración final (mM) Reacción de 1 x cantidad (μL) Cantidad (μL) x 50 reacciones Extracto (%) * 25 2.50 125.00 Glutamato de magnesio 100 3.5 0.35 17.50 K-glutamato 2000 80 0.40 20.00 4 x aminoácidos Master Mix 8.0 2 2.50 125.00 10 x energía solución Master Mix 1.00 50.00 Plantilla del mRNA (ng/μL) * 2000 4000 2.00 100.00 50% PEG-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00 Inhibidor de Rnasa, murino 0.10 5.00 Agua desionizada estéril 0.75 37.50 Volumen (μL) de la reacción: 10 Tabla 4: Componentes de optimizado V. natriegens celular libre de mezcla principal reacción para la plantilla de la DNA y mRNA plantilla.    Haga clic aquí para descargar este archivo en Excel. Mg 2 + Calibración Reacción de 1 x cantidad (μL) Reacción de 1 x cantidad (μL) Cantidad (μL) x 100 reacciones Cantidad (μL) x 100 reacciones Final (mM) Stock 100 mM Mg-Glu diH 2 0 100 mM Mg-Glu Desionizada H2O 2.5 0 0.00 1.00 0 100 3.5 1 0.10 0.90 10 90 4.5 2 0.20 0.80 20 80 5.5 3 0.30 0.70 30 70 Volumen (μL) de la reacción: 10 K + Calibración Reacción de 1 x cantidad (μL) Reacción de 1 x cantidad (μL) Cantidad (μL) x 100 reacciones Cantidad (μL) x 100 reacciones Final (mM) Stock 2000 mM K-Glu diH 2 0 2000 mM K-Glu Desionizada H2O 40 30 0.15 1.85 12 148 80 70 0.35 1.65 28 132 160 150 0.75 1.25 60 100 320 310 1.55 0.45 124 36 Volumen (μL) de la reacción: 10 Ion calibración libre reacción Master Mix Componente Concentración común (mM) Concentración final (mM) Reacción de 1 x cantidad (μL) Cantidad (μL) x 50 reacciones Extracto (%) * 25 2.50 125.00 Glutamato de magnesio Variable Variable 1.00 50.00 K-glutamato Variable Variable 2.00 100.00 4 x aminoácidos Master Mix 8.0 2 2.50 125.00 10 x energía solución Master Mix 1.00 50.00 Plásmido de ADN (ng/μL) * 1000 250 0.25 12.50 50% PEG-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00 T7 polimerasa del RNA 1.00 50.00 Inhibidor de Rnasa, murino 0.10 5.00 Agua desionizada estéril 0.00 0.00 Volumen (μL) de la reacción: 10 Tabla 5: Ion concentración calibración maestra se mezcla.    Haga clic aquí para descargar este archivo en Excel. Mapa de calibración ión CF 40 mM K+ 80 mM K+ 160 mM K+ 320 mM K+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2.5 mM Mg2 + A 3,5 mM Mg2 + B 4.5 mM Mg2 + C 5.5 mM Mg2 + D Tabla 6: Mapa de calibración Ion.    Haga clic aquí para descargar este archivo en Excel. Condiciones de almacenamiento y vida útil de los componentes de la CF Componente Ubicación de almacenamiento Vida útil Medios de cultivo estériles LB-V2 4 ° C 3-6 meses V. natriegens crudo Extracto de célula -80 ° C 1-3 semanas 100 mM Mg-glutamato A la temperatura ambiente 6 meses 2000 mM K-glutamato A la temperatura ambiente 6 meses 50% PEG-8000 A la temperatura ambiente 6 meses 10 x energía solución Master Mix -80 ° C 3-6 meses 4 x aminoácidos Master Mix -80 ° C 3-6 meses Plantilla de ADN plásmido lineal -20 ° C 6-12 meses mRNA plantilla -80 ° C 3-4 semanas Tabla 7: Condiciones de almacenamiento libre y útil vida.    Haga clic aquí para descargar este archivo en Excel.

Discussion

Este protocolo ha sido optimizado para el tipo salvaje V. natriegens y medios de crecimiento bacteriano de LB suplementado con sales de V2 (Tabla de materiales). Otras cepas de V. natriegens pueden cultivarse de manera similar para generar extractos crudos de la célula sin células reacciones; sin embargo, su uso requiere optimización adicional del presente Protocolo. Además, este sistema de expresión de proteínas libres de células se ha optimizado con 3 bisfosfoglicérico ácido (3-PGA) como la fuente de regeneración de energía primaria. Pueden utilizarse otras fuentes de regeneración de energía; sin embargo, la optimización de reactivos y la calibración probablemente sea necesaria para obtener alto rendimiento proteína expresión10,11.

Atención específica a varios pasos críticos en el presente Protocolo asegurará de extracto de la máxima productividad de alto rendimiento producción de proteínas libres de células. En primer lugar, debe preparar un extracto crudo de la célula de V. natriegens cultivos de células en una fase media exponencial de crecimiento; producción de proteínas es máxima cuando las culturas alcanzan un OD600 = 1,0 ± 0,2. Mientras que la producción de proteínas libres de células es posible de células cosechadas en un rango de densidades ópticas, previamente hemos encontrado que las células cosechadas en un estado exponencial de crecimiento rendimiento significativamente más proteína9. Los efectos observados de densidad óptica en el rendimiento de extracto crudo de la célula son consistentes con los reportados para otros sistemas de expresión libres de células derivadas de las células cultivadas en condiciones de cultura lote1. Porque V. natriegens crece a un ritmo rápido, es fundamental para monitorear de cerca las densidades ópticas de las culturas. En general, se espera que V. natriegens culturas reproducible deben llegar a un OD600 de 1.0 en 1−1.5 h utilizando este protocolo; sin embargo, las condiciones de crecimiento individuales como el uso de desconciertan frente a frascos no desconcertado, que afecta la aireación o aire versus la incubación del agua, que afecta a la velocidad y estabilidad de temperatura de incubación, pueden alterar el tiempo de crecimiento. Además, se recomienda que al menos 250 mL de V. natriegens en un matraz de 1 L desconcertado para asegurar un balín grande de la célula en la cosecha de fácil manipulación y transferencia de la cultura. Esto mejora en gran medida el éxito de la preparación de extracto crudo de la célula así como aumenta el volumen total de extracto producido de un balín. Cuando use preparación de escala más pequeña, los reactivos y condiciones de cultivo pueden ajustarse adecuadamente. Fermentación a gran escala, mayor optimización de las condiciones de cultivo puede requerir. Finalmente, para asegurar una producción alta en proteínas, es fundamental que los gránulos de la célula se procesan inmediatamente después de la cosecha, o dentro de 1−2 días de almacenamiento a-80 ° C.

La lisis apropiada de la pelotilla de la célula por sonicación de pulso es fundamental para el éxito de la expresión de la proteína sin células y suele ser el aspecto más difícil del presente Protocolo para los nuevos usuarios. Por lo general, una pelotilla bien sometidas a lisis producirá un significativo volumen de extracto líquido que esté libre de escombros. El extracto debe ser levemente viscoso pero puede pipetearse fácilmente al tomar en el almacenamiento de los tubos antes flash congelación en nitrógeno líquido. Figura 3 muestra una representación de una pelotilla bien sometidas a lisis (Figura 3A) en comparación con un balín mal sometidas a lisis (figura 3B) tras el paso de post lisis centrifugación. Una indicación importante de lisis celular completa es una célula cruda Extracto de proteína total concentración > 20 mg / mL según lo determinado por un análisis de proteína total (paso 2.13). Sonicación excesiva o calentamiento excesivo del extracto crudo celular daña la maquinaria celular, que no se puede determinar sin tener que realizar una reacción sin células. Por lo tanto, es altamente beneficiosa probar la eficacia del extracto con una reacción de control antes de dedicar mucho tiempo y esfuerzo a las aplicaciones de expresión de proteínas aguas abajo. Optimización adicional puede ser necesario para el equipo de sonicación diferentes, los pasos de sonicación de pulso descritos han sido altamente reproducibles en nuestras manos.

El uso de la plantilla de ADN lineal derivado de amplificación PCR, enzima de la restricción digestión o síntesis gen comercial puede aumentar significativamente la capacidad de producción de proteínas de alto rendimiento y rápida en sistemas de expresión libre24. Aunque se ha demostrado la producción de proteínas de plantilla lineal amplificado PCR, la producción de estas reacciones son aproximadamente 13.5-fold inferior con respecto a reacciones utilizando plásmidos plantilla de la DNA en proporciones equimolares9. Esto es principalmente debido a la inestabilidad de la plantilla de ADN linear que es degradado por las nucleasas endógenas presentes en V. natriegens extracto crudo de la célula. Mientras phage de la lambda GamS de proteína se ha utilizado previamente para proteger la DNA Linear plantilla24,25, se encontró incompatible con V. natriegens extractos de9. Además, mientras que el aumento de la concentración de la plantilla de la DNA linear puede permitir un mayor rendimiento de proteína, su rápida degradación en el extracto crudo de la célula seguirá siendo un problema importante.

Una solución para superar la degradación de plantilla de ADN lineal puede ser complementar las reacciones sin células con plantilla del mRNA generado por transcripción in vitro de ADN lineal. Por otro lado, el uso de un inhibidor de la Rnasa ofrece una protección significativa contra la degradación de transcripción de mRNA y proteína apreciables rendimientos pueden obtenerse en el formato libre reacción de 10 μL (figura 5AB). Clonación de DNA lineal en una plantilla circular a través de la ligadura de TA, TOPO clonación Asamblea de Golden Gate y otros métodos de recombinación pueden utilizarse para evitar la degradación de la plantilla. Sin embargo, más métodos para la inhibición de la actividad de nucleasa será necesarios para la expresión de la proteína eficiente utilizando la plantilla de la DNA linear.

Hasta la fecha, se han propuesto varios métodos para la preparación del extracto crudo de proteína libre expresión9,10,11,26. En el desarrollo de este protocolo, se intentó maximizar la accesibilidad del usuario, reducir costos y minimizar pasos lentos. Por ejemplo, un rendimiento de alto valor proteico se consigue mediante un proceso de centrifugación de sonicación de dos etapas simple y no requiere Homogenizadores celulares, pasos largos de diálisis o reacción de la segunda vuelta. Es fácil de ejecutar en un corto periodo de tiempo y no requiere alto nivel de experiencia de laboratorio. Por lo tanto, puede ayudar a facilitar la libre expresión como un estándar para la investigación académica aplicada y diseño de procesos industriales.

Este protocolo amplía el conjunto de herramientas disponible para la investigación y la utilidad de V. natriegens, un organismo no modelo con propiedades biológicas únicas. Mayor rendimiento de proteína se logra mediante el empleo de reacciones semi – o completamente-continuo sin células, para permitir la regeneración de energía, reabastecimiento de aminoácidos y la eliminación de residuos3,5,27. Además, la ingeniería de tipo salvaje V. natriegens para producir cepas deficientes en DNasa o Rnasa, eliminación de caminos metabólicos deletéreos y compitiendo y la expresión de tRNAs adicional podrían realzar grandemente la producción de proteínas en Este sistema28,29. Como nos desvela la biología subyacente a su rápido crecimiento, más desarrollo de V. natriegens sistemas libres de células puede acelerar las capacidades de producción biológica y permiten robusta expresión de péptidos terapéuticos, moléculas pequeñas y sintético materiales.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Ciencias de médicas General 1U01GM110714-01 y el Departamento de energía DE-FG02-02ER63445. Los autores desean agradecer al Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam y Dr. Edgar Goluch consejos útiles en la construcción de la sección de protocolo de este manuscrito.

Materials

15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask – 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution – 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048
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Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).
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