DREADD kontrollü Nöronal Aktivitekronik Manipülasyon için Non-invaziv Stratejiler
Summary
Burada farelerde kemogenetik kullanarak nöronal aktiviteyi kronik olarak kontrol etmek için iki non-invaziv yöntem açıklanmıştır. Göz damlaları günlük klozapin-N-oksit (CNO) sunmak için kullanıldı. Ayrıca içme suyunda CNO uzun süreli uygulanması için iki yöntem açıklar. Kronik nöronal kontrol için bu stratejiler hayvanların stresini azaltarak minimal müdahale gerektirir.
Abstract
Kemogenetik stratejiler nöronal aktivitenin uzaktan kontrolü için güvenilir araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Bunlar arasında, tasarımcı reseptörleri sadece tasarımcı ilaçlar tarafından aktive (DREADDs) modern nörolojik kullanılan en popüler kemogenetik yaklaşım haline gelmiştir. Çoğu çalışma, hedeflenen nöronal popülasyonun akut aktivasyonu/inhibisyonu için uygun olan tek bir intraperitoneal enjeksiyon kullanarak ligand klozapin-N-oksit (CNO) sunar. Bununla birlikte, DREADD kontrollü nöronların kronik modülasyonu için stratejilersadece birkaç örnek vardır, bunların çoğunluğu cerrahi müdahale gerektiren dağıtım sistemlerinin kullanımına dayanır. Burada, ligand CNO’yu farelerdeki nöral popülasyonu kronik olarak manipüle etmek için teslim etmek için iki non-invaziv stratejiyi genişletiyoruz. CNO ya tekrarlayan (günlük) göz damlaları kullanılarak ya da kronik olarak hayvanın içme suyu yoluyla uygulandı. Bu non-invaziv paradigmalar CNO tedavileri boyunca devam tasarımcı reseptörlerinin sağlam aktivasyonu ile sonuçlanır. Burada açıklanan yöntemler nöronal aktivitenin kronik DREADD aracılı kontrolü için alternatifler sunmakta ve serbestçe hareket eden hayvanlardaki davranışları değerlendirmek için tasarlanmış deneylerde, daha az invaziv CNO dağıtım yöntemlerine odaklanarak yararlı olabilir.
Introduction
Nöroloji alanındaki teknik gelişmeler, bilim adamlarının belirli nöronal popülasyonların aktivitesini tamolarak belirlemelerine ve kontrol etmelerine olanak sağlamıştır 1. Bu daha iyi nöronal devrelerin temelini ve hayvan davranışı üzerindeki etkilerini anlamak için katkıda bulunmuştur, yanı sıra, kurulan dogmalar revize2,3. Bu yeni araçlar arasında, optogenetik ve kemogenetik stratejiler keşiflerin kalitesi üzerinde değil, aynı zamanda deneylerin tasarlanıptasarlanmabiçimi üzerinde de derin bir etkiye sahiptir 4. Bu yazıda, nöronların aktivasyonunu mühendislik reseptör-ligand stratejileri ile kontrol etmek için kemogenetik stratejilere odaklanıyoruz. Tasarımcı reseptörleri sadece tasarımcı ilaçlar tarafından aktive (DREADDs) nöronal aktiviteuzaktan kontrol için en popüler kemogenetik araçlardan birini temsil, Roth tarafından gözden olarak 20165. DREADDs özellikle bir inert ligand tarafından aktive modifiye muskcarinik asetilkolin reseptörleri kullanmak, klozapin-N-oksit (CNO)6.
Çoğu çalışmada, akut bir şekilde mühendislik reseptörlerinin aktivasyonunun dozajını ve zamanlamasını etkili bir şekilde kontrol eden intraperitoneal (yani) enjeksiyonlar tarafından uygulanan CNO kullanılır. Ancak, tekrarlayan veya kronik DREADD aktivasyonu gerektiğinde, birden fazla i.p. enjeksiyonunun kullanımı mümkün değildir. Bu sorunu gidermek için, kronik CNO doğum için farklı stratejiler bildirilmiştir, implante minipumpsdahil 7 ve intrakranial kanüller8,9. Farklı ölçüde, tüm bu stratejiler hayvanların stres ve ağrıneden 10, ve aynı zamanda test edilecek davranışsal tepkiler üzerinde doğrudan bir etkisi olabilir cerrahi bir müdahale gerektirir11. Burada kronik CNO doğumu için üç non-invaziv strateji açıklıyoruz.
Bu amaçla, fareler stereotaksik bir adeno-ilişkili virüs ile hipokampus enjekte edildi (AAV) uyarıcı M3 muscarinic reseptörü (hM3Dq) bir mühendislik sürümünü kodlama ligand CNO tarafından aktive patlama gibi ateş yol açar nöronlar6. Daha önce CNO içeren tek bir göz damlası etkili DREADD ifade nöronların sağlam bir aktivasyon ortaya olabilir gösterilmiştir12. Burada göz damlalarının tekrarlayan teslimatı için değiştirilmiş bir yöntem açıklıyoruz. Tasarımcı reseptörlerinin kronik ve sürekli kontrolünü sağlamak için, daha sonra içme suyu aracılığıyla farelere CNO sunmak için non-invaziv bir strateji açıklar. Son olarak, sınırlı bir zaman dilimi içinde içme suyunda CNO teslim etmek için alternatif bir paradigma açıklar. Fareler lokomotor aktivitesi, yanı sıra içme davranışı ve tatlı kalori çözeltileri tüketimi, çoğunlukla ışık / karanlık döngüsü13,14karanlık kısmı ile sınırlıdır. Bu nedenle farenin sakaroz tercihine dayalı bir protokol uyguladık. AAV-enfekte hücrelerde hemen erken gen c-Fos indüksiyon ölçerek, nöronal aktivasyon için bir okuma olarak12,15, Biz bu CNO dağıtım stratejileri sağlam dreadd kontrollü nöronlar üzerinde genişletilmiş etkinleştirmek bulundu Süre.
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDs uzaktan nöronal aktivite17işlemek için popüler ve etkili bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. CNO teslimatı için alternatif stratejilerin tasarımı, belirli deneysel ayarlar için mevcut seçeneklerin yelpazesini geniş ölçüde artıracaktır. Buna ek olarak, CNO teslimi için non-invaziv stratejiler doğrudan hayvan Sağlığını etkileyebilir yan etkileri azaltarak sonuçların herhangi bir potansiyel yanlış yorumlanmasını en aza indirmek. Burada, CNO teslimatı iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü ‘ndeki intramural araştırma programı (ZIA MH002964-02) tarafından desteklenmiştir. Biz NIMH IRP Kemirgen Davranış Çekirdek (ZIC MH002952) desteğine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. 神经科学. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
