Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD
Summary
Aquí describimos dos métodos no invasivos para controlar crónicamente la actividad neuronal utilizando quimiogenética en ratones. Se utilizaron gotas para los ojos para administrar clozapina-N-óxido (CNO) diariamente. También describimos dos métodos para la administración prolongada de CNO en agua potable. Estas estrategias para el control neuronal crónico requieren una intervención mínima reduciendo el estrés de los animales.
Abstract
Las estrategias quimiogenéticas han surgido como herramientas fiables para el control remoto de la actividad neuronal. Entre ellos, los receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) se han convertido en el enfoque quimiogenético más popular utilizado en la neurociencia moderna. La mayoría de los estudios suministran el ligando clozapina-N-óxido (CNO) utilizando una única inyección intraperitoneal, que es adecuada para la activación/inhibición aguda de la población neuronal objetivo. Sin embargo, sólo hay algunos ejemplos de estrategias para la modulación crónica de las neuronas controladas por DREADD, la mayoría de las cuales se basan en el uso de sistemas de administración que requieren intervención quirúrgica. Aquí, ampliamos dos estrategias no invasivas para entregar el ligando CNO para manipular crónicamente la población neuronal en ratones. CNO se administró mediante el uso de gotas para los ojos repetitivas (diarias) o crónicamente a través del agua potable del animal. Estos paradigmas no invasivos dan como resultado una activación robusta de los receptores de diseño que persistieron a lo largo de los tratamientos de CNO. Los métodos descritos aquí ofrecen alternativas para el control crónico mediado por DREADD de la actividad neuronal y pueden ser útiles para experimentos diseñados para evaluar el comportamiento en animales en movimiento libre, centrándose en métodos de entrega de CNO menos invasivos.
Introduction
Los avances técnicos en el campo de la neurociencia han permitido a los científicos identificar y controlar con precisión la actividad de determinadas poblaciones neuronales1. Esto ha contribuido a entender mejor la base de los circuitos neuronales ysu impacto en el comportamiento animal, así como, la revisión de dogmas establecidos 2,3. Entre estas nuevas herramientas, las estrategias optogenéticas y quimiogenéticas han tenido un profundo impacto no sólo en la calidad de los descubrimientos, sino también en la forma en que se conciben y diseñanlosexperimentos 4. En el presente manuscrito, nos centramos en estrategias quimiogenéticas para controlar la activación de las neuronas a través de estrategias de receptor-ligand diseñadas. Los receptores de diseño activados exclusivamente por los medicamentos de diseño (DREADD) representan una de las herramientas quimiogenéticas más populares para el control remoto de la actividad neuronal, según lo revisado por Roth 20165. Los DREADD utilizan receptores de acetilcolina muscarínicos modificados que son activados específicamente por un ligando inerte, clozapina-N-óxido (CNO)6.
La mayoría de los estudios utilizan CNO administrado por inyecciones intraperitoneales (i.p.), que controla eficazmente la dosis y el momento de la activación de receptores diseñados de una manera aguda. Sin embargo, cuando se requiere activación repetitiva o crónica DREADD, el uso de múltiples inyecciones de i.p. se vuelve inviable. Para abordar este problema, se han reportado diferentes estrategias para la entrega crónica de CNO, incluyendo minibombas implantadas7 y cánulas intracraneales8,9. En diferentes grados, todas estas estrategias causan el estrés y el dolor de los animales10,y requieren una intervención quirúrgica que también podría tener un impacto directo en las respuestas conductuales que se probarán11. Aquí, describimos tres estrategias no invasivas para el parto crónico de CNO.
Para ello, los ratones fueron inyectados estereotaxicamente en el hipocampo con un virus asociado a adeno (AAV) que codifica una versión de ingeniería del receptor muscarínico M3 excitatorio (hM3Dq) que cuando se activa por el ligando CNO conduce a la cocción en forma de ráfaga de neuronas6. Anteriormente se demostró que una sola gota ocular que contiene CNO puede efectivamente obtener una activación robusta de las neuronas que expresan DREADD12. Aquí describimos un método modificado para la entrega repetitiva de gotas para los ojos. Para lograr un control crónico y sostenido de los receptores de diseño, a continuación describimos una estrategia no invasiva para entregar CNO a ratones a través del agua potable. Por último, describimos un paradigma alternativo para la entrega de CNO en agua potable durante una ventana de tiempo restringida. La actividad locomotora de los ratones, así como el comportamiento de beber y el consumo de soluciones calóricas dulces, se limitan principalmente a la porción oscura del ciclo de luz/oscuridad13,14. Por lo tanto, adoptamos un protocolo basado en la preferencia del ratón por la sacarosa. Mediante la medición de la inducción del gen inmediato-temprano c-Fos en células infectadas por AAV, como una lectura para la activación neuronal12,15, encontramos que estas estrategias de administración de CNO activan de forma robusta las neuronas controladas por DREADD en Duraciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los DREADD han surgido como un enfoque popular y eficaz para manipular remotamente la actividad neuronal17. El diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO aumentará ampliamente el espectro de opciones disponibles para configuraciones experimentales específicas. Además, las estrategias no invasivas para la entrega de CNO minimizan cualquier posible interpretación errónea de los resultados mediante la reducción de los efectos secundarios adversos que pueden afectar directamente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros del Instituto Nacional de Salud Mental (ZIA MH002964-02). Nos gustaría agradecer el apoyo del NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
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