Stratégies non invasives pour la manipulation chronique de l'activité neuronale contrôlée par DREADD
Summary
Ici nous décrivons deux méthodes non-invasives pour commander chroniquement l’activité neuronale utilisant la chimiogénétique chez les souris. Des gouttes d’oeil ont été employées pour livrer le clozapine-N-oxyde (CNO) quotidiennement. Nous décrivons également deux méthodes pour l’administration prolongée de CNO dans l’eau potable. Ces stratégies de contrôle neuronal chronique nécessitent une intervention minimale réduisant le stress des animaux.
Abstract
Les stratégies chimiogénétiques sont apparues comme des outils fiables pour le contrôle à distance de l’activité neuronale. Parmi ceux-ci, les récepteurs de concepteur exclusivement activés par les drogues de concepteur (DREADDs) sont devenus l’approche chimiogénétique la plus populaire utilisée dans les neurosciences modernes. La plupart des études fournissent le ligand clozapine-N-oxyde (CNO) à l’aide d’une seule injection intrapéritonéale, qui convient à l’activation/inhibition aigue de la population neuronale ciblée. Il n’existe cependant que quelques exemples de stratégies de modulation chronique des neurones contrôlés par DREADD, dont la majorité reposent sur l’utilisation de systèmes d’administration nécessitant une intervention chirurgicale. Ici, nous élargissons sur deux stratégies non-invasives pour fournir le CNO ligand pour manipuler chroniquement la population neurale chez les souris. CNO a été administré soit en utilisant répétitif (quotidiennement) des gouttes oculaires, ou chroniquement à travers l’eau potable de l’animal. Ces paradigmes non invasifs se traduisent par une activation robuste des récepteurs de concepteur qui ont persisté tout au long des traitements CNO. Les méthodes décrites ici offrent des alternatives pour le contrôle chronique DREADD-négocié de l’activité neuronale et peuvent être utiles pour des expériences conçues pour évaluer le comportement chez les animaux en mouvement libre, en se concentrant sur les méthodes de livraison CNO moins invasives.
Introduction
Les progrès techniques dans le domaine des neurosciences ont permis aux scientifiques d’identifier et de contrôler précisément l’activité de certaines populations neuronales1. Cela a contribué à mieux comprendre la base des circuits neuronaux et leur impact sur le comportement animal, ainsi que, la révision des dogmes établis2,3. Parmi ces nouveaux outils, les stratégies optogénétiques et chimiogénétiques ont eu un impact profond non seulement sur la qualité des découvertes, mais aussi sur la façon dont les expériences sont conçues et conçues4. Dans le présent manuscrit, nous nous concentrons sur les stratégies chimiogénétiques pour contrôler l’activation des neurones par l’intermédiaire de stratégies de récepteur-ligand modifiées. Les récepteurs de concepteur exclusivement activés par les drogues de concepteur (DREADDs) représentent l’un des outils chimiogènes les plus populaires pour le contrôle à distance de l’activité neuronale, tel qu’examiné par Roth 20165. Les DREADD utilisent des récepteurs d’acétylcholine muscarinique modifiés qui sont spécifiquement activés par un ligand inerte, clozapine-N-oxyde (CNO)6.
La plupart des études utilisent CNO administré par injections intrapéritonéales (i.p.), qui contrôle efficacement la posologie et le moment de l’activation des récepteurs modifiés d’une manière aigue. Cependant, lorsque l’activation dREADD répétitive ou chronique est nécessaire, l’utilisation de multiples injections i.p. devient irréalisable. Pour résoudre ce problème, différentes stratégies pour la livraison chronique de CNO ont été rapportées, y compris les minipompes implantées7 et les cannulas intracrâniennes8,9. À des degrés différents, toutes ces stratégies causent le stress et la douleur des animaux10, et nécessitent une intervention chirurgicale qui pourrait également avoir un impact direct sur les réponses comportementales à tester11. Ici, nous décrivons trois stratégies non-invasives pour l’administration chronique de CNO.
À cette fin, des souris ont été injectées stéréotaxiquement dans l’hippocampe avec un virus adéno-associé (AAV) codant une version machinée du récepteur muscarinique M3 excitateur (hM3Dq) qui, lorsqu’il est activé par le ligand CNO conduit à l’éclatement-comme le tir de neurones6. Il a été précédemment montré qu’une seule goutte d’oeil contenant CNO peut effectivement susciter une activation robuste des neurones DREADD-exprimant12. Ici nous décrivons une méthode modifiée pour la livraison répétitive des gouttes d’oeil. Pour obtenir un contrôle chronique et durable des récepteurs de concepteur, nous décrivons ensuite une stratégie non invasive pour livrer CNO aux souris par l’eau potable. Enfin, nous décrivons un paradigme alternatif pour la livraison de CNO dans l’eau potable au cours d’une fenêtre de temps restreint. L’activité locomotrice des souris, ainsi que le comportement de consommation et la consommation de solutions caloriques douces, sont la plupart du temps limitées à la partie foncée du cycle lumière/obscurité13,14. Par conséquent, nous avons adopté un protocole basé sur la préférence de la souris pour le saccharose. En mesurant l’induction du gène c-Fos immédiat-précoce dans les cellules infectées par l’AAV, comme une lecture pour l’activation neuronale12,15, nous avons constaté que ces stratégies de livraison CNO activent vigoureusement les neurones contrôlés par DREADD sur étendu Durées.
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDs ont émergé comme une approche populaire et efficace pour manipuler à distance l’activité neuronale17. La conception de stratégies alternatives pour la livraison de CNO augmentera largement le spectre des options disponibles pour des paramètres expérimentaux spécifiques. En outre, les stratégies non invasives pour la livraison de CNO minimisent toute mauvaise interprétation potentielle des résultats en réduisant les effets secondaires indésirables qui peuvent avoir un impact di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par le programme de recherche intra-muros de l’Institut national de santé mentale (ZIA MH002964-02). Nous tenons à remercier le soutien du NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. 神经科学. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
