Niet-invasieve strategieën voor chronische manipulatie van de DREADD-gecontroleerde Neuronale activiteit
Summary
Hier beschrijven we twee niet-invasieve methoden om chronisch controle Neuronale activiteit met behulp van chemogenetica in muizen. Oogdruppels werden gebruikt om Clozapine-N-oxide (CNO) dagelijks te leveren. We beschrijven ook twee methoden voor langdurige toediening van CNO in drinkwater. Deze strategieën voor chronische neuronale controle vereisen minimale interventie vermindering van de stress van dieren.
Abstract
Chemogenetische strategieën zijn ontstaan als betrouwbare instrumenten voor de afstandsbediening van neuronale activiteit. Onder deze, Designer receptoren uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) zijn uitgegroeid tot de meest populaire chemogenetische aanpak gebruikt in de moderne neurowetenschappen. De meeste studies leveren de ligand Clozapine-N-oxide (CNO) met behulp van een enkele intraperitoneale injectie, die geschikt is voor de acute activering/remming van de beoogde neuronale populatie. Er zijn echter slechts enkele voorbeelden van strategieën voor chronische modulatie van DREADD-gecontroleerde neuronen, waarvan de meerderheid afhankelijk is van het gebruik van toedieningssystemen die chirurgische interventie vereisen. Hier breiden we uit op twee niet-invasieve strategieën voor het leveren van de ligand CNO om de neurale populatie in muizen chronisch te manipuleren. CNO werd toegediend hetzij door het gebruik van repetitieve (dagelijkse) oogdruppels, of chronisch door het drinkwater van het dier. Deze niet-invasieve paradigma’s resulteren in een robuuste activering van de Designer receptoren die persistent gemaakt gedurende de CNO behandelingen. De hier beschreven methoden bieden alternatieven voor de chronische DREADD-gemedieerde controle van neuronale activiteit en kan nuttig zijn voor experimenten ontworpen om gedrag te evalueren in vrij bewegende dieren, gericht op minder invasieve CNO leveringsmethoden.
Introduction
Technische vooruitgang op het gebied van de neurowetenschappen hebben wetenschappers in staat om nauwkeurig identificeren en controleren van de activiteit van bepaalde neuronale populaties1. Dit heeft bijgedragen aan het beter begrijpen van de basis van neuronale circuits en hun invloed op dierlijk gedrag, evenals, herziening van gevestigde dogma’s2,3. Onder deze nieuwe instrumenten, optogenetische en chemogenetische strategieën hebben een ingrijpende invloed niet alleen op de kwaliteit van de ontdekkingen, maar ook op de manier waarop experimenten worden bedacht en ontworpen4. In het huidige manuscript richten we ons op chemogenetische strategieën voor het beheersen van de activering van neuronen via engineered receptor-ligand-strategieën. Designer receptoren uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) vertegenwoordigen een van de meest populaire chemogenetische hulpmiddelen voor de afstandsbediening van neuronale activiteit, zoals beoordeeld door Roth 20165. DREADDs maken gebruik van gemodificeerde muscarinische acetylcholine-receptoren die specifiek worden geactiveerd door een inert ligand, Clozapine-N-oxide (CNO)6.
De meeste studies gebruiken CNO toegediend door intraperitoneale (i.p.) injecties, die effectief regelt de dosering en timing van engineered receptoren activering in een acute mode. Echter, wanneer repetitieve of chronische DREADD activering vereist is, het gebruik van meerdere i.p. injecties onhaalbaar worden. Om dit probleem op te lossen, zijn verschillende strategieën voor de chronische CNO-levering gemeld, waaronder geïmplanteerde minipumps7 en intracraniële canules8,9. In verschillende mate veroorzaken al deze strategieën de dieren stress en pijn10, en vereisen een chirurgische ingreep die ook een directe invloed kan hebben op de gedrags responsen die moeten worden getest11. Hier beschrijven we drie niet-invasieve strategieën voor de chronische CNO-levering.
Voor dit doel, muizen werden stereotaxically geïnjecteerd in de Hippocampus met een adeno-geassocieerde virus (Aav) coderen van een Engineered versie van de excitatory M3 muscarinerge receptor (hM3Dq) dat wanneer geactiveerd door de ligand CNO leidt tot de burst-achtige afvuren van neuronen6. Eerder werd aangetoond dat een enkele oogdruppel die CNO bevat, effectief een robuuste activatie van DREADD-uitdrukken van neuronen12kan opwekken. Hier beschrijven we een gemodificeerde methode voor de repetitieve levering van oogdruppels. Om chronische en aanhoudende controle van de ontwerpers receptoren te bereiken, beschrijven we volgende een niet-invasieve strategie om CNO aan muizen door het drinkwater te leveren. Ten slotte beschrijven we een alternatief paradigma voor het leveren van CNO in drinkwater tijdens een beperkt tijdsvenster. Muizen motorische activiteit, evenals het drinkgedrag en de consumptie van zoete calorie-oplossingen, zijn meestal beperkt tot het donkere gedeelte van de licht/donkere cyclus13,14. Daarom hebben we een protocol aangenomen dat gebaseerd is op de voorkeur van de muis voor sucrose. Door het meten van de inductie van de directe-vroege gen c-fos in Aav-geïnfecteerde cellen, als een uitlezen voor neuronale activering12,15, we vonden dat deze CNO levering strategieën krachtig activeren dreadd-gecontroleerde neuronen over uitgebreide Duur.
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDs zijn ontstaan als een populaire en effectieve aanpak voor het op afstand manipuleren van neuronale activiteit17. Het ontwerp van alternatieve strategieën voor CNO-levering zal in grote lijnen het spectrum van beschikbare opties voor specifieke experimentele instellingen vergroten. Bovendien, niet-invasieve strategieën voor de levering van CNO minimaliseren van eventuele verkeerde interpretatie van de resultaten door het verminderen van nadelige bijwerkingen die rechtstreeks van invloed k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma aan het National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02). We willen graag de steun van de NIMH IRP rodent Behavioral core (ZIC MH002952) bedanken.
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. 神经科学. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
