שאינם פולשנית אסטרטגיות עבור מניפולציה כרונית של פעילות עצבית מבוקרת של הראסטות
Summary
כאן אנו מתארים שתי שיטות שאינן פולשני לשלוט כרוניות בפעילות עצבית באמצעות כימוגנטיקה בעכברים. טיפות עיניים שימשו כדי לספק clozapine N-תחמוצת (CNO) מדי יום. אנו מתארים גם שתי שיטות לניהול ממושך של CNO ב שתיית מים. מחייב התערבות מינימלית. בהפחתת הלחץ של בעלי החיים
Abstract
אסטרטגיות כימוגנטיות התפתחה ככלי אמין עבור שליטה מרחוק של פעילות עצבית. בין אלה, קולטני מעצב המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) הפכו את הגישה הפופולרית ביותר כימוגנטית בשימוש במדעי המוח המודרנית. רוב המחקרים מספקים את ליגו clozapine-N-תחמוצת (CNO) באמצעות הזרקת הצפק יחיד, אשר מתאים הפעלה חריפה/עיכוב של האוכלוסייה העצבית המיועד. יש, עם זאת, רק כמה דוגמאות של אסטרטגיות עבור אפנון כרונית של נוירונים מבוקרת ראסטות, רוב אשר מסתמכים על השימוש במערכות המסירה הדורשות התערבות כירורגית. כאן, אנו להרחיב על שתי אסטרטגיות שאינן פולשני עבור אספקת ליגו CNO כדי כרוני לתמרן את האוכלוסייה העצבית בעכברים. לא ניתן להשתמש ב-CNO באמצעות טיפות עיניים חוזרות (יומיות), או באופן כרוני דרך מי השתייה של בעל החיים. אלה שאינם פולשני התוצאה הפעלה איתנה של קולטני המעצב כי התעקש במהלך טיפולים CNO. השיטות המתוארות כאן מציעות חלופות עבור שליטה מתווכת כרונית של הפעילות העצבית ועשויה להיות שימושית עבור ניסויים שנועדו להעריך את ההתנהגות בחיות נעות בחופשיות, התמקדות בשיטות מסירה פחות פולשנית של CNO.
Introduction
פיתוחים טכניים בתחום מדעי המוח אפשרו למדענים לזהות ולשלוט באופן מדויק על הפעילות של אוכלוסיות נוירואליות מסוימות1. זה תרם כדי להבין טוב יותר את הבסיס של מעגלים עצביים והשפעתם על התנהגות בעלי חיים, כמו גם, תיקון הקימו דוגמות2,3. בין הכלים הללו רומן, אלקטרואופטיקה השיטות הגנטיות כימוגנטיות היו השפעה עמוקה לא רק על איכות של תגליות, אלא גם על הדרך ניסויים הם תוכנן ועוצב4. בכתב היד הנוכחי, אנו מתמקדים אסטרטגיות כימוגנטיות עבור שליטה על הפעלת הנוירונים באמצעות הנדסה קולטן-ligand אסטרטגיות. קולטני מעצבים המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) מייצגים את אחד הכלים הפופולריים כימוגנטי השלט רחוק של פעילות עצבית, כפי שנבדקו על ידי רוט 20165. הראסטות לנצל השתנה קולטני אצטילכולין שונה מופעלים במיוחד על ידי אינרטי, clozapine N-תחמוצת (CNO)6.
רוב המחקרים משתמשים ב-CNO על ידי זריקות הצפק (כותרת), אשר שולטת ביעילות על המינון והתזמון של הפעלת קולטנים מהונדסים בצורה חריפה. עם זאת, כאשר הפעלה חוזרת או כרונית של ראסטות נדרש, השימוש בזריקות כאלה מרובות להפוך לבלתי אפשרי. כדי לענות על בעיה זו, אסטרטגיות שונות עבור משלוח cno כרונית דווחו, כולל משאבות מושתלים7 ו בתוך הצינורית בתוך הבית8,9. על הרחבות שונות, כל האסטרטגיות האלה גורמות החיות מתח וכאב10, ודורשים התערבות כירורגית כי יכול להיות גם השפעה ישירה על התגובות התנהגותיות להיבדק11. כאן, אנו מתארים שלוש אסטרטגיות לא פולשני עבור משלוח CNO כרונית.
למטרה זו, עכברים היו stereotaxically הוזרק בהיפוקמפוס עם וירוס הקשורים adeno (AAV) קידוד גרסה מהונדסים של קולטן המוסקריאית M3 (hM3Dq) כי כאשר מופעל על ידי ליגו CNO מוביל את הירי כמו פרץ של נוירונים6. בעבר הוכח כי עין טיפה אחת המכילה CNO יכול לעורר ביעילות הפעלה חזקה של מעורר הנוירונים ביטוי12. כאן אנו מתארים שיטה שונה למסירה חוזרת של טיפות עיניים. כדי להשיג שליטה כרונית ומתמשכת של קולטני מעצבים, אנחנו הבאים לתאר אסטרטגיה לא פולשנית לספק CNO לעכברים דרך מי השתייה. לבסוף, אנו מתארים פרדיגמה חלופית לאספקת CNO במים לשתייה במהלך חלון זמן מוגבל. עכברים locomotor פעילות, כמו גם התנהגות השתייה ואת הצריכה של פתרונות קלוריק מתוק, מוגבלים בעיקר לחלק האפל של מחזור אור/כהה13,14. לכן, אימצנו פרוטוקול המבוסס על העדפת העכבר על סוכרוז. על ידי מדידת אינדוקציה של המוקדם מוקדם הגן c-Fos בתאים שנדבקו aav, כבדיקה עבור הפעלה עצבית12,15, מצאנו כי אלה cno אסטרטגיות מסירה מכבש להפעיל מבוקרת ראסטות הנוירונים על המורחבת שכים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדרדים התפתחה כגישה פופולרית ואפקטיבית לתפעול מרחוק פעילות עצבית17. העיצוב של אסטרטגיות חלופיות עבור מסירת CNO יהיה להגדיל בהרחבה את הספקטרום של אפשרויות הזמינות עבור הגדרות נסיוניות ספציפיות. בנוסף, אסטרטגיות שאינן פולשנית עבור המסירה של CNO למזער את כל הפרשנות הפוטנציאלית של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי תוכנית המחקר התוך-ציור במכון הלאומי לבריאות הנפש (ZIA MH002964-02). היינו רוצים להודות לתמיכה של הליבה התנהגותית מכרסם NIMH (ZIC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. 神经科学. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
