DREADD控制神经活动慢性操作的非侵入性策略
Summary
在这里，我们描述了两种非侵入性方法，使用小鼠的化学遗传学来长期控制神经元活动。眼药水用于每天提供氯扎平-N-氧化物（CNO）。我们还描述了在饮用水中长期使用CNO的两种方法。这些慢性神经元控制策略需要最少的干预，以减少动物的压力。
Abstract
化学遗传策略已成为远程控制神经元活动的可靠工具。其中，由设计药物（DREADDs）完全激活的设计师受体已成为现代神经科学中最常用的化学遗传学方法。大多数研究使用单次腹肌注射提供配体氯扎平-N-氧化物（CNO），该注射适用于靶向神经元人群的急性活化/抑制。然而，只有几个例子，长期调制的DREADD控制神经元的策略，其中大多数依赖于使用需要手术干预的交付系统。在这里，我们扩展了两种非侵入性策略，用于提供配体CNO，以长期操纵小鼠的神经群。CNO要么使用重复（每日）眼药水施用，要么通过动物的饮用水长期施用。这些非侵入性范式导致在整个CNO治疗过程中持续不断的设计师受体的强健激活。此处描述的方法为慢性 DREADD 介导的神经元活动控制提供了替代方法，并且对于旨在评估自由移动动物行为的实验非常有用，重点是侵入性较低的 CNO 传递方法。
Introduction
神经科学领域的技术进步使科学家能够精确识别和控制特定神经元群体的活动1。这有助于更好地了解神经元回路的基础及其对动物行为的影响，以及修改既定的教条2，3。在这些新工具中，光遗传学和化学遗传策略不仅对发现的质量产生了深远的影响，而且对实验的构思和设计方式也产生了深远的影响。在本手稿中，我们重点介绍通过工程受体配体策略控制神经元激活的化学遗传学策略。设计师受体完全由设计师药物（DREADDs）激活，是远程控制神经元活动的最流行的化学遗传工具之一，如Roth 20165所回顾。DREADDs利用经修饰的肌血性乙酰胆碱受体，由惰性配体、氯扎平-N-氧化物（CNO）6特别激活。
大多数研究使用由腹内（i.p.）注射管理的CNO，它有效地控制在急性方式工程受体活化的剂量和时间。然而，当需要重复或慢性DREADD激活时，使用多次i.p.注射变得不可行。为了解决这个问题，已经报道了慢性CNO输送的不同策略，包括植入微型泵7和颅内管8，9。在不同程度上，所有这些策略导致动物压力和疼痛10，并要求手术干预，也可以有直接影响的行为反应被测试11。在这里，我们描述了三种用于慢性CNO输送的非侵入性策略。
为此，小鼠在海马区被立体地注入，其与腺相关病毒（AAV）编码了刺激性M3肌肉受体（hM3Dq）的工程版本，当被配体CNO激活时，导致爆发式发射。神经元6.此前已经表明，一个含有CNO的眼滴可以有效地引起DREADD表达神经元12的强健激活。在这里，我们描述了一个改进的方法，重复交付眼药水。为了实现对设计受体的慢性和持续控制，我们接下来将描述一种非侵入性策略，通过饮用水向小鼠提供CNO。最后，我们描述了在有限时间内在饮用水中提供 CNO 的替代范例。老鼠运动活动，以及饮酒行为和甜热溶液的消耗，大多局限于黑暗部分的光明/黑暗周期13，14。因此，我们采用了基于小鼠对蔗糖偏好的协议。通过测量AAV感染细胞中早期基因c-Fos的诱导，作为神经元活化12、15的读出，我们发现这些CNO传递策略在扩展的神经元上强力激活DREADD控制神经元持续时间。
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADD已经成为远程操作神经元活动的一种流行和有效的方法17。CNO交付的替代策略的设计将广泛增加可用于特定实验设置的选项范围。此外，通过减少直接影响动物健康的副作用，非侵入性的提供CNO策略最大限度地减少了对结果的任何潜在误解。在这里，我们描述了两种用于 CNO 交付的非侵入性策略，这些策略赋予了 DREADD （hM3Dq） 强大的激活，并提供广泛的可能性。此外，我们?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家精神卫生研究所（ZIA MH002964-02）的校内研究项目的支持。我们要感谢NIMH IRP Rodent行为核心（ZIC MH002952）的支持。
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
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