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免疫与感染

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Published: June 23, 2019
doi:
10.3791/59427
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1Research Institute McGill University Health Centre, 2Department of Biological Sciences,Université de Québec à Montréal, 3Department of Microbiology & Immunology,McGill University, 4Department of Medicine, Division of Infectious Diseases,McGill University, 5Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal, 6Département de microbiologie, infectiologie et immunologie,Université de Montréal

Summary

Describimos un método para procesar el líquido de lavado broncoalveolar y la sangre periférica emparejada de individuos infectados crónicamente por el VIH en terapia antirretroviral para evaluar los reservorios pulmonares del VIH. Estos métodos dan lugar a la adquisición de células T CD4 altamente puras y macrófagos alveolares que posteriormente pueden utilizarse para inmunofenotipado y cuantificaciones de ADN/ARN de VIH por reacción en cadena de polimerasa ultrasensible.

Abstract

La broncoscopia es un procedimiento médico por el cual se inyecta salina normal en los pulmones a través de un broncoscopio y luego se aplica la succión, eliminando el líquido de lavado broncoalveolar (BAL). El líquido BAL es rico en células y, por lo tanto, puede proporcionar una “instantánea” del entorno inmunológico pulmonar. Los cd4 t son los reservorios de VIH mejor caracterizados, mientras que hay pruebas sólidas que sugieren que los macrófagos tisulares, incluidos los macrófagos alveolares (AM), también sirven como reservorios virales. Sin embargo, todavía se desconoce mucho sobre el papel de los hombres de aMe en el contexto del establecimiento y el mantenimiento de los embalses de VIH. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo para procesar el líquido BAL para obtener células que pueden ser utilizadas en ensayos virológicos e inmunológicos para caracterizar y evaluar las poblaciones celulares y subconjuntos dentro del pulmón es relevante para entender el papel de los pulmones como VIH Embalses. Aquí, describimos este protocolo, empleando técnicas estándar como la centrifugación simple y la citometría de flujo. Las células T CD4 y los AM pueden utilizarse para aplicaciones posteriores, incluidos el inmunofenotipado y la cuantificación del ADN y ARN del VIH.

Introduction

Uno de los desafíos más importantes a los que se enfrenta una cura a la infección por el VIH es la presencia del reservorio latente del VIH, que provoca un rebote de la viremia plasmática tras la interrupción de la terapia antirretroviral (ART)1,2. Si bien el reservorio del VIH durante el TAR a largo plazo está bien documentado en varios compartimentos tisulares, incluidos los órganos linfoides secundarios, el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) y el sistema nervioso central (SNC), los pulmones se han pasado por alto como un área de estudio desde la era pre-ART3. Sin embargo, los pulmones desempeñan un papel central en la patogénesis del VIH. De hecho, los síntomas pulmonares fueron uno de los primeros indicadores de infecciones oportunistas relacionadas con el SIDA4. Incluso en la era moderna del TAR, las personas con VIH corren un mayor riesgo de desarrollar enfermedades pulmonares infecciosas y no infecciosas que las personas sin VIH. Por ejemplo, las personas con infección por VIH tienen un riesgo elevado de infección invasiva por neumonía estreptocócica, así como de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)5,6. Además, la coinfección de la tuberculosis (TB) y el VIH es un desafío importante de la salud pública en ciertas regiones del mundo, enparticular en el Africa subsahariana, ya que las personas infectadas por el VIH tienen entre 16 y 27 veces más probabilidades de tener tuberculosis que las personas sin VIH 7. Aunque se han propuesto algunas explicaciones para esta susceptibilidad a la infección pulmonar y a las enfermedades crónicas8,9,10, los mecanismos celulares precisos por los cuales las personas con VIH suprimido la carga viral plasmática sigue teniendo un mayor riesgo de que las complicaciones pulmonares no hayan sido completamente aclaradas. Es importante destacar que el VIH es un factor de riesgo muy fuerte para la infección pulmonar y las enfermedades crónicas, independientemente del estado de tabaquismo6.

Por lo tanto, el análisis del entorno inmunológico del pulmón es crucial para entender su papel en la salud y la enfermedad. Aunque no son invasivas, las muestras de esputo inducidas tienden a contener grandes cantidades de células epiteliales y desechos con linfocitos pulmonares raros y sin AM, limitando su papel a aplicaciones específicas. Por el contrario, no se pueden obtener grandes biopsias de tejido en ausencia de sospecha de enfermedad debido a los riesgos asociados de sangrado significativo y neumotórax (colapso pulmonar). Además, la mayoría de las células inmunitarias pulmonares se encuentran principalmente en el nivel de la mucosa, donde los pulmones son estimulados continuamente por antígenos durante la respiración. Para ello, la broncoscopia para obtener líquido BAL tiene la ventaja de proporcionar un acceso relativamente seguro a linfocitos y amantes (ver Figura 1). Los macrófagos constituyen la mayor proporción de células dentro del líquido BAL, seguidos de los linfocitos11. Por lo tanto, es útil establecer un método mediante el cual el líquido BAL pueda procesarse para su uso en aplicaciones posteriores, como inmunofenotipado, cultivo celular, transcriptomica o cualquier otra aplicación. El protocolo para el procesamiento del fluido BAL descrito aquí está adaptado de los procedimientos generales descritos previamente y optimizados para los diversos ensayos posteriores empleados. Esta metodología permite el aislamiento de las células inmunitarias de la mucosa linfoide pulmonar y mieloide para su caracterización fenotípica y funcional, así como una evaluación del reservorio de VIH en adultos que viven con vih.

Para establecer este protocolo, utilizamos los siguientes criterios para reclutar participantes del estudio15. Para que los participantes pudieran participar en este estudio, tenían que ser personas infectadas por el VIH que cumplieran los siguientes criterios: (1) sobre TAR durante al menos 3 años; (2) la carga viral suprimida (VL) durante un mínimo de 3 años; (3) Recuento de células T CD4 de 200/mm3; (4) dispuestoa a someterse a la espirometría de investigación y la broncoscopia. Los pacientes con los siguientes criterios fueron excluidos del estudio: (1) contraindicación(es) a broncoscopia; 2) alto riesgo de sangrado: coagulopatía o en terapia con warfarina o clopidogrel; (3) trombocitopenia (plaquetas bajas); (4) infección pulmonar activa u otro proceso pulmónico agudo; (5) embarazada/intentando quedar embarazada.

Protocol

Este protocolo de investigación se estableció directamente sobre la base de los principios incluidos en la Declaración de Helsinki y recibió la aprobación de las Juntas de Revisión Institucional del Centro de Salud de la Universidad McGill (RI-MUHC, #15-031), la Universidad de Quebec Montreal (UQAM, #602) y el Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CR-CHUM, #15-180). 1. Lavage Broncoalveolar NOTA: Esta sección describe la broncoscopia realizada por un respirologista con licencia con la ayuda de un terapeuta respiratorio16,17. Preparar las piezas de aparato necesarias para el procedimiento, incluyendo un broncoscopio y salina. Administrar aerosol anestésico en la parte posterior de la garganta del paciente. Evite el uso excesivo de anestesia tópica cuando sea posible. Aplicar cables cardíacos al pecho con el fin de controlar la frecuencia cardíaca y el ritmo y una sonda de oxígeno al primer dedo de una mano con el fin de controlar la saturación de oxígeno. Inserte la cánula nasal en las fosas nasales para proporcionar oxígeno suplementario. Coloque al paciente, preferiblemente en la posición supina. Administrar la sedación de la siguiente manera: midazolam 0,01-0,04 mg/kg y fentanilo 50-100 g (para facilitar la comodidad del paciente y minimizar el reflejo de la tos) por vía intravenosa, en presencia de un relestrólogo o anestesista. Avance el broncoscopio flexible hasta que se acople en los bronquios subsegmentales deseados. Inculcar salina (50-60 ml a la vez) con la jeringa, y luego aplicar una succión suave (50-80 mmHg). El líquido de lavado se acumulará en la jeringa y luego se transferirá a un recipiente de recogida. Repita el lavado a un total de 200-300 ml de lavado. Recoja al menos 100 ml de líquido BAL si es posible. Coloque el líquido BAL sobre hielo. 2. Aislamiento de células BAL NOTA: El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en condiciones estériles en un armario de seguridad biológica, clase II (BSL2) o superior. Mantenga las muestras de BAL en hielo hasta que se procesen. Vortex el BAL en el tubo de recogida original y transferirlo a un tubo de 50 ml utilizando una pipeta serológica. Si el líquido BAL parece muy turbio o contaminado por tejido filamentoso, filtre el líquido a través de un filtro de malla de nylon de 70 m en un nuevo tubo de 50 ml. Centrífuga a 200 x g durante 10 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 ml. Rompe suavemente el pellet con una punta de pipeta y resuspenderlo en 1 ml de medio RPMI 1640. Transfiera 1 ml del sobrenadante a cada uno de los tubos de microcentrífuga de 10x 1,5 ml y el sobrenadante restante a tubos de 15 ml, 10 ml en cada uno. Almacene todos los tubos sobrenadantes a -80 oC. Procesar el pellet celular BAL. Resuspenda el pellet en 10 ml de RPMI 1640 por cada 25 ml de la muestra original. Centrífuga a 200 x g durante 10 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml (descarte después de asegurarse de que hay suficientes células en el pellet). Resuspende el pellet en 1 ml de RPMI 1640 + 10% de suero bovino fetal (FBS) y cuenta usando trippan azul y un hemocitómetro.NOTA: Si el líquido BAL no está separado por la adherencia de las células antes de la clasificación, proceda a la sección 4. 3. Adherencia de células BAL (opcional) NOTA: Este protocolo alternativo se puede realizar antes o en lugar de la clasificación de celdas. El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en condiciones estériles en un armario BSL2 (o superior). Transfiera el número deseado de celdas BAL para su clasificación a un nuevo tubo de 15 ml y comporte el volumen correcto para 1,5 x 106 macrófagos/ml. Placa 2 ml de células por poca en placas de 6 pocillose incubar durante 2 h a 37oC con 5 % de CO2, para dejar tiempo de adherencia. Después de la incubación, aspirar cuidadosamente los medios que contienen células no adherentes y transferirlos a un tubo de 15 ml. Centrífuga a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Retire el sobrenadante y resuspende a 1 x 107 células/ml en solución salina con búfer de fosfato (PBS) + 2 % FBS y transfiera la suspensión a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. Esta fracción de linfocitos ya está lista para manchar para la clasificación celular. A las celdas adherentes restantes de la placa, añadir 1 ml por pozo de solución de desasociación celular (ver la Tabla de Materiales)e incubar durante al menos 15 min a 37 oC con 5% de CO2,hasta que las células se separen fácilmente de la placa con una punta de pipeta. Raspar suavemente pero raspar a fondo las células adherentes de la superficie del pozo usando una punta de pipeta, y utilizar 1 ml de líquido en el pozo para ayudar con el desprendimiento. Transfiera las células a un nuevo tubo de 15 ml. Lavar los pozos con 1 ml de PBS y añadirlo al mismo tubo. Insino el contenido del tubo a 5 ml con PBS. Centrífuga a 300 x g durante 10 minutos en RT. Retire el sobrenadante, resuspende a 1 x 107 células/mL PBS + 2% FBS, y transfiera la suspensión a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. Esta fracción mieloide ahora está lista para mancharpara la clasificación celular. 4. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica NOTA: El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en condiciones estériles en un armario BSL2 (o superior). El mismo día de la broncoscopia (generalmente directamente antes de la recolección balo), obtener seis tubos de sangre venosa de un donante en tubos de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) (aproximadamente 10 ml por tubo). Transfiera la sangre centrifugando los tubos sanguíneos a 300 x g durante 15 min a RT. Transfiera el plasma a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en alícuotas de 1 ml y guárdelo a -80 oC. Realice la separación de gradientes de densidad. Añadir 2 ml de RPMI 1640 a cada tubo sanguíneo y mezclar bien con una pipeta serológica. Transfiera a 3 tubos de 50 ml y componer el volumen de cada tubo a 25 ml con RPMI 1640. Preparar otro lote de tubos de 3x 50 ml, cada uno con 20 ml de medio de separación de linfocitos (LSM) (ver la Tabla de Materiales)en RT. Capa lenta y suavemente los 25 ml de sangre diluida en la parte superior del LSM para cada uno de los tres tubos, sosteniendo el tubo en un ángulo de 45o . Centrífuga a 600 x g durante 25 min a RT con baja aceleración y sin desaceleración (freno apagado). Realizar un lavado de células mononucleares de sangre periférica (PPBM). Transfiera la capa de células en la interfaz de las dos fases líquidas del tubo a un tubo de 50 ml utilizando una pipeta serológica; si hay más de 30 ml de volumen, divídalo en dos tubos. Coma el volumen en cada tubo a 50 ml con PBS. Centrifugar a 700 x g durante 5 min en RT y eliminar tanto sobrenadante como sea posible. Resuspenda el pellet y coma el volumen a 25 ml con PBS. Centrifugar a 350 x g durante 10 minutos en RT y eliminar tanto sobrenadante como sea posible. Repita el paso de lavado descrito en el paso 4.4.3. Resuspenda el pellet en 5 ml de PBS + 2% FBS y cuente las células. 5. Clasificación de células BAL enteras y PBMCs NOTA: El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en condiciones estériles en un BSL2 (o superior). Prepare el búfer de clasificación que contenga PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (pH 7.4). Prepare tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml con 1 ml de FBS para la colección de subconjuntos de celdas ordenadas. Realice la tinción. Preparar 3 tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml, cada uno para BAL (células enteras o fracciones de linfocitos y mieloides después de la adherencia) y PPBM (ver sección 4). Para cada subconjunto, prepare un tubo con celdas para ordenar y dos tubos de 5 x 105 celdas para usar para controles de compensación de manchas sin mancha y de viabilidad. Centrífuga a 350 x g durante 5 min a 4oC. Retire los sobrenadores, resuspenda las celdas para los controles en 100 s de PBS y guárdelas a 4 oC hasta que los controles de compensación se puedan preparar como se describe en el paso 5.2.6. Preparar una dilución 1:20 del reactivo de bloqueo del receptor Fc (FcR) en PBS + 5% FBS (ver la Tabla de Materiales-para prevenir la unión inespecífica de anticuerpos a FcR en células que expresan FcR). Resuspenda las células para ordenarlas en 1 x 107 células en 250 s de mezcla de bloqueo de FcR. Incubarlos durante 1 h a 4oC. Después de la incubación, añadir el cóctel de anticuerpos apropiado (ver Tabla 1) a las células e incubar durante 1 h a 4 oC en la oscuridad. Después de 1 h de tinción, añadir 1 ml de PBS a las células y centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 oC. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en el búfer de clasificación para tener 1 x 107 celdas en 250 l. Filtre las células a través de un filtro de 70 m si es necesario. Preparar controles de compensación. Agregue tres gotas cada una de las perlas de compensación de control negativo y Ig antiratón (ver la Tabla de Materiales)por 1 ml de PBS en un tubo de microcentrífuga y transfiera 100 ml a cada tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml que se utilizará para la compensación. Preparar un tubo para cada fluorocromo presente en el cóctel que se va a utilizar. Añadir 1 l de cada anticuerpo en el cóctel a un tubo diferente que contenga perlas. Añadir 1 l de mancha de viabilidad a uno de los tubos de 5 x 105 células reservadas en el paso 5.2.1. Incubar durante 20 min a 4oC en la oscuridad. Añadir 1 ml de PBS a cada tubo y centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 oC. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 250 s de PBS. Conservar a 4oC en la oscuridad hasta que sea necesario. Ordene las células por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en tubos de recolección preparados con 1 ml de FBS y gire suavemente para recubrir los lados de los tubos con suero. Ordene las células BAL a baja presión. Células de puerta primero para excluir el ruido e incluir vivo, CD45+ celdas, y dentro de esta puerta de población hacia fuera celdas doblete (Ver Figura 3). Dentro de la población mieloide más grande ordenar CD206 y CD169 células positivas dobles como AMs; dentro de la población de linfocitos más pequeñas aislar CD3+ células y ordenar las poblaciones positivas únicas CD4 y CD8 (ver Figura3; estrategia de gating detallada en la sección de resultados representativos). Al ordenar los PBMC, las células de la puerta primero para excluir el ruido e incluir vivo, CD45+ células, y dentro de esta población salen las células del doblete. A continuación, puerta en las células CD3 y dentro de la población CD3- la puerta primero en CD14 y ordenar monocitos únicos positivos, y luego dentro de la puerta de la población CD3+ en CD4 y CD8 y ordenar ambas poblaciones positivas individuales (estrategia de gating detallada en el Sección de Resultados Representativos. 6. Inmunofenotipado de AMs y PBMCs NOTA: El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en condiciones estériles en un armario BSL2 (o superior). Agregue hasta 1 millón de AMs y PBMCs a dos tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml separados. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4oC y retirar el sobrenadante. Realice el bloqueo de FcR para mejorar la especificidad de la tinción de anticuerpos. Para ello, resuspenda las celdas en 100 sde PBS + 2% FBS y agregue 1,4 s de reactivo de bloqueo FcR. Incubar durante 20 min a 4 oC. Realice manchas extracelulares. Después de la incubación con el bloque FcR, añadir el cóctel de anticuerpos extracelulares deseado, vórtice los tubos, e incubar durante 1 h a 4 oC en la oscuridad. Lavar 2 veces añadiendo 500 s de PBS y centrifugando a 350 x g durante 5 min a 4 oC. Prepárese para la fijación y la permeabilización (consulte la Tabla de materiales para reactivos específicos utilizados). Prepare la solución de permeabilización con tampón de permeabilización de 1 parte y tampón diluyente de 3 partes. Resuspender el pellet en 1 ml de solución de permeabilización e incubar durante 40 min a 4oC en la oscuridad. Preparar la solución de lavado utilizando 1 tampón de lavado de piezas y 4 partes H2O. Añadir 2 ml de solución de lavado a las células permeabilizadas y centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 oC. Retire el sobrenadante. Realizar tinción intracelular. Resuspender las células en 100 l de solución de lavado 1x, añadir los anticuerpos intracelulares deseados, vórtice los tubos e incubar durante al menos 1 h a 4 oC en la oscuridad. Añadir 2 ml de solución de lavado y centrífuga a 350 x g durante 5 min en RT. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 200 ml de PBS. Almacene las células a 4 oC en la oscuridad hasta que sea necesario. 7. Resto de células BAL NOTA: El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en condiciones estériles en un armario BSL2 (o superior). Números de células que permiten, criopreserva las células vivas del pellet celular BAL (del paso 2.2.2). Prepare medios de congelación que contengan 90% FBS + 10% sulfóxido de dimetil (DMSO). Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4oC. Retire el sobrenadante y resuspenda en 1,5 ml de medio de congelación en un vial criogénico. Transfiera los viales criogénicos a un recipiente de congelación de velocidad controlada (ver la Tabla de Materiales)y colóquelos a -80 oC. Transfiera las células a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo una vez alcanzada la temperatura. Conservar las células BAL como pellets secos. Transfiera las células restantes a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrífuga en una centrífuga de contra-top a 6.000 x g durante 1 min. Retire tanto sobrenadante como sea posible sin molestar el pellet. Conservar el pellet a -80oC. 8. Cuantificación del ADN y el ARN del VIH NOTA: El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en condiciones estériles en un armario BSL2 (o superior). Cuantificación total del ADN del VIH Para evitar la inhibición de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con residuos de lisados BAL, utilice un kit de extracción de ADN (ver la Tabla de Materiales)para extraer ADN de una muestra de células BAL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice 15 l de este ADN combinado con una mezcla maestra en el paso de preamplificación descrito a continuación (paso 8.1.3). Preparar diluciones de curva estándar. Como se mencionó anteriormente, utilice un kit de extracción de ADN para extraer ADN de un pellet de 2 x 106 células ACH-2 (ver la Tabla de Materiales). Después de la elución del ADN, realice diluciones seriales 10 veces del ADN ACH-2 para generar seis diluciones, que van desde 3 x 105 células a 3 células por 15 oL. Realice un paso de preamplificación. En una sala separada, prepare la mezcla maestra para n + 2 muestras que comprenden 1ta de polimerasa, 3 mM de MgCl2, 300 M dNTPs, y 2,5 U de polimerasa de ADN Taq (ver la Tabla de Materiales)y 300 nM de cada uno de los cuatro imprimadores (ver paso 8.1.3.2). Realizar todas las medidas en pozos triplicados. Utilice los imprimadores hCD3OUT5′, hCD3OUT3′, ULF1 y UR1 para generar ADN amplificado a partir de CD3 humanos y VIH (consulte las secuencias de la Tabla2). Tenga en cuenta que ambos genes están preamplificados en el mismo tubo. Mezcle suavemente y gire por el tubo para asegurar una mezcla completa. Distribuya 35 ml de mezcla maestra por poca en una placa de PCR de 96 pocillos y añada 15 ml de ADN estándar o de muestra. El volumen total de reacción es de 50 l. Realizar la preamplificación (desnaturalización a 95oC durante 8 min, seguida de 12 ciclos de 95oC durante 1 min, 55oC durante 40 s, 72oC durante 1 min y alargamiento a 72oC durante 15 min). Realice PCR en tiempo real. Para cuantificar CD3 y VIH DNA, prepare dos mezclas maestras que contengan 1 mezcla maestra de reacción pcR (véase la Tabla de materiales),imprimaciones apropiadas de 1.250 nM y sonda de 100 nM. Utilice los imprimadores HCD3IN5′ y HCD3IN3′ y la sonda CD3 FamZen para cuantificar cd3 humano en una sola reacción, y los imprimadores UR2 y LambdaT y la sonda UHIV FamZen para cuantificar el ADN del VIH en otra reacción (véanse las secuencias de la Tabla2). Distribuya 13,6 l de cada mezcla en tubos adaptados al qPCR. Diluir el producto PCR de preamplificación a 1:10 en agua estéril, DNase, RNase y proteasa libre. Añadir 6,4 l de cada muestra diluida a 13,6 l de mezcla qPCR en tubos adaptados a qPCR para un volumen de reacción total de 20 l. Realizar la PCR en tiempo real utilizando el siguiente programa: desnaturalización a 95 oC durante 4 min y 40 ciclos de 95oC para 3 s y 60oC para 10 s con adquisición única. Extrapolar el número de copias del VIH y equivalentes de células numéricas en cada tubo de reacción de las curvas estándar. Calcular el número de copias de ADN VIH/106 células. Cuantificación del ARN del VIH Extraiga el ARN de una muestra de células BAL, utilizando un kit de extracción de ARN (consulte la Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice 17 l de este ARN en el paso de transcripción y preamplificación inversa que se describe a continuación (paso 8.2.4). El ARN LTR-gag sintetizado in vitro y cuantificado con precisión se utiliza como estándar; se introduce en un extracto de ARN de donante sano para la normalización de GUSB. Preparar seis diluciones seriales de 10 veces de esta norma, correspondientes a 3 x 105 células a tres copias de ARN LTR-gag en 17 l. Distribuya 17 ml de cada dilución estándar y cada muestra en una placa de PCR de 96 pocillos y trate las muestras con DNase (ver la Tabla de Materiales)durante 10 min a 25 oC para eliminar el ADN genómico contaminante. Detenga la reacción añadiendo 2 sL de EDTA de 25 mM e incubar las muestras durante 10 min a 65 oC. Realice la transcripción inversa (RT) y la PCR de preamplificación. Realice este paso utilizando un kit RT-PCR de un solo paso (consulte la Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice las imprimaciones GUSB forward 1, GUSB reverse 1, UR1 y ULF1 para generar ADNc amplificado tanto del GUSB humano como del gen de limpieza y del ARN del VIH LTR-gag (véanse las secuencias de la Tabla2). Los valores GUSB se utilizarán para normalizar los valores del VIH. Distribuya 31 ml de mezcla maestra por pocido en la misma placa pcR de 96 pocillos que contenga las normas y muestras tratadas con DNase y mezcle bien. El volumen total de reacción es de 50 l. Ejecutar la placa durante 16 ciclos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con una temperatura de recocido de 55 oC. Realice PCR en tiempo real. Prepare dos mezclas maestras que contengan 1 mezcla maestra de reacción PCR (como se ha mencionado en el paso 8.1.4.1), imprimaciones apropiadas de 1250 nM y sonda de 100 nM. Utilice imprimaciones GUSB forward 2, GUSB reverse 2 y sonda GUSB-HEX para cuantificar el ADNC GUSB en una sola reacción; utilizar los imprimadores UR2, LambdaT e sondeo UHIV FamZen para cuantificar el VIH cDNA en otra reacción (consulte las secuencias de la Tabla 2). Distribuya 13,6 l de cada mezcla maestra en tubos adaptados al qPCR. Diluir los productos de PCR de preamplificación RT 1:10 en agua estéril, DNase, RNase y proteasa libre, y añadir 6,4 l de cada muestra diluida o estándar a la mezcla de PCR adecuada. El volumen total de reacción es de 20 s. Realizar la PCR en tiempo real utilizando el siguiente programa: desnaturalización a 95 oC durante 4 min y 40 ciclos de 95 oC para 3 s y 60 oC para 10 s con adquisición única (seleccione el canal verde para FamZen y amarillo para HEX).

Representative Results

En la mayoría de los no fumadores, el líquido BAL se recibe en un recipiente estéril y es un líquido ligeramente turbio de color amarillo-naranja. El líquido puede ser de color más rosado si el donante se sometió a biopsias endobronquiales durante la broncoscopia y se produjo algo de sangrado. El líquido puede ser de color más oscuro si el donante es fumador. Después de la centrifugación, el sobrenadante BAL será casi claro y ligeramente naranja, mientras que el pellet celular puede variar en color de blanquecino a marrón muy oscuro, dependiendo de la condición de la muestra y si el donante era fumador o no. Al contar toda la muestra de BAL, se pueden visualizar diferentes tipos de células, incluyendo macrófagos más grandes y redondos de alrededor de 17 m de diámetro y linfocitos redondos más pequeños de alrededor de 7,3 m de diámetro18,19 (ver Figura 2). Los macrófagos se agrandan en los fumadores en aproximadamente un 40. La distinción entre los tipos de células permite contar los macrófagos y linfocitos por separado. También puede haber algunos desechos visibles en el campo, especialmente en muestras de fumadores. Los macrófagos son el tipo celular más abundante en el BAL, representando aproximadamente el 85% de las células en los no fumadores20,y están enriquecidos en fumadores por lo que pueden parecer casi exclusivos. Las células BAL tienen una tendencia a agregar, por lo que deben mezclarse bien durante todas las manipulaciones. El pellet puede aparecer oscuro incluso después de varios pasos de lavado. Si los desechos filamentosos son evidentes en la fracción después de la tinción para la clasificación celular, pase las células a través de un filtro de 70 m antes de ejecutarlas a través del clasificador de células. La clasificación de las células BAL debe realizarse a baja presión para garantizar tamaños de gotas lo suficientemente grandes como para acomodar los macrófagos. Las celdas se bloquean primero para incluir todas las celdas CD45+21 y, a continuación, se basan en la viabilidad para asegurarse de que se excluyen todas las celdas muertas (consulte la figura3). A continuación, se eligen células singlet y, dentro de esta, dos poblaciones se agaran en función del tamaño y la morfología, a saber, células mieloides más grandes y linfocitos más pequeños (ver Figura 3). Dentro de las células más grandes, las células se anegan en CD20622,23 y CD16922 y las celdas doble-positivas se ordenan como AMs, mientras que dentro de las células más pequeñas, CD3+ las células se eligen y se anegan en CD4 y CD8; Las células unipositivas y CD8 de CD4 se ordenan (consulte la figura 3). Los marcadores utilizados se eligieron sobre la base de fenotipos descritos previamente de los AMs, como el receptor de la nonósa CD206, que se encuentra en las células fagocíticas23,y el receptor de sialoadhesina CD16922. Al clasificar los PPM, las células se cierran primero en dispersión hacia adelante y lateral, lo que debe mostrar una población de linfocitos homogénea, todos los cuales se toman, excluyendo el ruido cerca del eje cero (datos no mostrados). La población está cerrada en viabilidad y CD45, y se utilizan células CD45+ en vivo. Esta población se cierra entonces en CD3; para aislar a los monocitos, la población CD3- se cierra posteriormente en CD14 y todas las células positivas individuales se clasifican. Para aislar los subconjuntos de linfocitos, las células CD3+ están cerradas en CD4 y CD8 y se ordenan las poblaciones positivas y celulares. Figura 1 : Visión general del protocolo. Esquema que muestra el flujo de trabajo del protocolo, incluidos los posibles usos posteriores de los ejemplos generados. PBMC – células mononucleares de sangre periférica; BAL – lavado broncoalveolar; LSM – medio de separación de linfocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Vista de campo del microscopio de todo el líquido BAL. Imágenes de microscopio de (A) un no fumador y (B) un fumador con linfocitos visibles (L), macrófagos (M) y glóbulos rojos (RBC). La ampliación es de 1.000x (10x ocular y 100x lente con inmersión en aceite). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Estrategia de gating representativa para la clasificación celular de células BAL enteras. Estrategia de gating utilizada para clasificar los macrófagos alveolares (AM), CD4 y CD8 T de muestras de células BAL enteras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Muestra Anticuerpo Fluorocromo Clon Volumen por prueba (L) BAL y PBMC Live/Dead APC-H7 – 1 CD45 PE-Cy7 HI30 5 CD3 Alexa700 UCHT1 2 CD4 PE-cy5 RPA-T4 4 CD8 BV605 SK1 3 SÓLO BAL CD206 Pe 19.2 10 CD169 BB515 7-239 5 Sólo PBMC CD14 BV786 M5E2 5 Tabla 1: Panel de flujo para la clasificación de células BAL enteras y PMI aislados. Objetivo Paso Primer nombre Secuencia de primer VIH ADN total o ARN LTR-Gag del VIH PCR de preamplificación UR1 5′-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3′ Ulf1 5′-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3′ PCR en tiempo real UR2 5′-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3′ LambdaT 5′-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3′ FamZen de UHIV: 5′-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3′ ADN CD3 PCR de preamplificación HCD3 fuera 5′ 5′-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3′ HCD3 fuera 3′ 5′-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3′ PCR en tiempo real HCD3 en 5′ 5′-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3′ HCD 3 en 3′ 5′-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3′ CD3 FamZen: 5′-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3′ ARN GUSB PCR de preamplificación GUSB Forward 1: 5′-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3′ GUSB Inverso 1: 5′- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3′ PCR en tiempo real GUSB Forward 2: 5′-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3′ GUSB Inverso 2: 5′- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3′ GUSB-HEX: 5′-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3′ Tabla 2: Secuencias de imprimación y sonda para la cuantificación del ADN del VIH y el ARN.

Discussion

Aquí describimos un método para procesar el líquido BAL para obtener células T CD4 y AM, junto con PBMCs emparejados, que se pueden estudiar para investigar el reservorio de VIH dentro de los pulmones. Recientemente informamos sobre la cuantificación del ADN del VIH en células T CD4 a partir de muestras de sangre periférica y BAL coincidentes, y nuestro grupo demostró que el VIH es 13 veces más abundante en los glóbulos T CD4 pulmonares que en los de sangre periférica15. Sin embargo, los niveles de ADN del VIH en los malens son dependientes de los donantes y, por lo tanto, hasta ahora, no ha habido una correlación constante entre los niveles de ADN del VIH en los linfocitos en comparación con los macrófagos15. El acceso a estos subconjuntos primarios de células macróforas, sin embargo, será una herramienta vital para interrogar esta pregunta y obtener una mejor comprensión de la carga viral en el pulmón en el contexto del reservorio del VIH.

En la era pre-ART y en varios otros estudios utilizando líquido BAL, los participantes se sometieron a broncoscopia con el fin de diagnosticar una sospecha de patología u obtener un diagnóstico microbiológico de los síntomas respiratorios3. Sin embargo, pudimos reclutar participantes sin ningún síntoma pulmonar activo o patologías y todos los participantes firmaron un formulario de consentimiento ético15. Pudimos reclutar participantes de nuestro centro que participaban en otros estudios, como un estudio de detección de espirometría para la enfermedad pulmonar obstructiva24,así como aquellos sometidos a otros procedimientos de investigación, como la leucoféresis y Colonoscopia. Investigaciones previas entre personas que viven con el VIH demostraron que el altruismo es un factor clave que motiva la participación en estudios de investigación25. Al igual que con muchos especímenes humanos, observamos una gran cantidad de variabilidad de persona a persona. No había manera de “predecir” de qué participantes obtendríamos BAL con rendimientos celulares buenos frente a los pobres. A diferencia de la sangre periférica, que produce un número bastante consistente de linfocitos, los números celulares en el líquido BAL son muy variables. Inyectar un mayor volumen de salina normal en los pulmones (con la esperanza de obtener un mayor retorno del líquido BAL) no siempre es posible, ya que los volúmenes más grandes de salina normal a menudo se asocian con más tos y un mayor riesgo de postbroncoscopia de fiebre. Nos dimos cuenta de que el uso de un broncoscopio de diámetro más pequeño (en lugar de mayor) permitió al relecionólogo llegar más profundamente a los bronquios y obtener líquido que contiene mayores cantidades de células. Un hallazgo consistente fue que los fumadores de tabaco tenían proporciones mucho mayores de AMs que los linfocitos dentro de su líquido BAL, lo que se espera cuando los AM envuelven escombros y partículas. Además, observamos que el líquido BAL de los fumadores contenía desechos que pueden bloquear el equipo utilizado, como las máquinas PCR y los citometros de flujo. Pueden observarse problemas similares en áreas de alta contaminación o en individuos expuestos con mayor frecuencia a la mala calidad del aire.

Con respecto a su papel en el establecimiento de los reservorios del VIH y la persistencia viral, la pureza de los células T CD4 y los AM es una consideración clave. Por esta razón, optamos por utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para obtener poblaciones celulares altamente puras. También es posible que el líquido BAL recogido pueda estar contaminado con sangre, ya que se espera un sangrado menor durante una broncoscopia; la presencia de células B ingenuas indicaría esto, y las células se pueden lavar en un tampón de lisis de glóbulos rojos para evitar este problema. Otro desafío con el estudio del líquido BAL se relaciona con la cuantificación de marcadores inflamatorios y citoquinas, que son importantes para entender la persistencia del VIH26. Como la salina inculcada diluye el líquido BAL, los niveles de mediadores inflamatorios y citoquinas pueden ser difíciles de medir. Aunque se ha propuesto un factor de corrección de la urea para dar cuenta de la dilución, hay relativamente poca literatura que describa su uso27,28.

Los aMs son altamente autofluorescentes, lo que plantea un problema durante la clasificación celular y el análisis fenotípico de citometría de flujo. En particular, el efecto es más pronunciado en los fumadores cuyos MAL pueden ser completamente de color negro, afectando significativamente a su autofluorescencia. Cuando se excita con un láser azul estándar de 488 nm, la autofluorescencia AM se encuentra en su apogeo en aproximadamente 540 nm, que se superpone con los espectros de fluorescencia de conjugados de uso común como FITC y PE29,30. Vale la pena señalar que dos láseres separados se pueden utilizar para excitar FITC y PE (por ejemplo, PE por el amarillo / verde y FITC por el láser azul 488). Para superar la autofluorescencia inherente con FITC, utilizamos AMs no manchados para determinar el fondo de autofluorescencia. Además, el uso de controles de fluorescencia menos uno (FMO) puede ser muy útil para combatir estos problemas técnicos. Se pueden utilizar perlas más grandes (p. ej., 7,5 m), que son más de tamaño para compensar las poblaciones de macrófagos, en comparación con las cuentas más pequeñas (por ejemplo, 3,0 m), que se pueden utilizar para compensar las poblaciones de linfocitos. Un enfoque aún más adecuado sería utilizar una pequeña fracción de celdas como los controles de una sola mancha, utilizando un marcador conocido y altamente expresado en el subconjunto, como HLA-DR o CD45, conjugado con cada uno de los fluorocromos deseados, lo que permitiría un marcador mucho más compensación precisa que se puede lograr con cuentas. En el caso de las muestras de los fumadores, esta táctica es particularmente útil ya que los macrófagos son mucho más grandes y más autofluorescentes. Además, a partir del paso de preparación, toda la muestra BAL podría ser cultivada en una placa antes de clasificarse como se describe en la sección 3 del protocolo, para permitir una separación de las poblaciones por adherencia. De esta manera, los macrófagos adherentes pueden aislarse de otras células no adherentes como los linfocitos. La compensación es mucho menos difícil si las poblaciones de linfocitos y AM se separan en lugar de examinarse juntas; sin embargo, confiar en la adherencia resultará en una pérdida de macrófagos, lo que es una consideración importante cuando los números de celda ya están limitando. También, un paso de adherencia podría resultar en la activación no deseada de monocitos adherentes, que puede afectar los resultados posteriores generados utilizando estas células. El valor de clasificar eficientemente las células en poblaciones más puras debe sopesarse frente a la restricción de tener menos de estas células para experimentos posteriores.

Otros modelos, sobre todo los modelos murinos, se han utilizado para estudiar las características inmunológicas de los macrófagos y la biología. Aunque estos modelos son extremadamente útiles y permiten una gran visión de un tipo de celda que es difícil de manipular, tienen limitaciones. Muchos de los marcadores de superficie celular varían entre ratones y humanos, de manera que el inmunofenotipo de los MAL humanos no se entiende completamente. Sin embargo, este sistema modelo requiere la agrupación de varios ratones para ensayos debido a los bajos números de celda disponibles de cada animal. Además, la necesidad de agrupar especímenes impide consideraciones de predisposición genética y sexo. Recientemente, se ha demostrado que el sexo juega un papel en la infectividad de los macrófagos por el VIH-1 debido a la expresión dispar del factor de restricción SAMHD-131. Los primates no humanos (NHP) representan el modelo más cercano a los seres humanos y facilitaron el estudio de la infección por el virus de inmunodeficiencia simio (SIV) y su efecto en el sistema inmunitario, proporcionando información sobre el papel de los macrófagos residentes en los tejidos en comparación con macrófagos derivados de monocitos. En los macacos de rhesus, también se ha demostrado que los macrófagos pulmonares se aíslan de BAL albergan un virus competente para la replicación; un ensayo de crecimiento viral (VOA) se utilizó para analizar el comportamiento del SIV en células residentes en tejidos32. Tal hallazgo es de un valor de investigación significativo, pero todavía debe ser validado en los seres humanos antes de que pueda ser aplicado, y el alto costo de usar NCP impide el uso de grandes poblaciones de muestras. Además, los MI humanos serán útiles para muchas otras aplicaciones, como los ensayos de infección viral/microbiana in vitro y en estudios de otros patógenos como la coinfección por tuberculosis/VIH.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean reconocer a sus funderos: los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR) (conceder #153082 a CC, MAJ, NC); el Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) que otorgó fondos a CC y MAJ y a la Facultad de Medicina de la Universidad McGill que concedió fondos a CC. Este estudio también fue apoyado en parte por los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR)- financiado por el equipo canadiense de la empresa de curación del VIH (CanCURE) Subvención HB2 – 164064 a MAJ, CC y NC. MAJ tiene la Cátedra de Investigación CIHR Canadá tier 2 en Inmunovirología y CC y NC poseen un premio de salario de investigación FRQ-S Junior 1 y Junior 2, respectivamente. ET posee un premio RI-MUHC Studentship MSc.

Además, los autores desean reconocer a Josée Girouard y a todo el personal clínico involucrado en la coordinación y obtención de las muestras, así como a los terapeutas respiratorios; Ekaterina Iourtchenko, Héléne Pagé-Veillette y Marie-Héléne Lacombe en la plataforma de inmunofenotipado RI- MUHC; y la Dra. Marianna Orlova para el suministro de las fotos de la microscopía. Lo más importante es que los autores desean dar las gracias a los muchos voluntarios sin los cuales esta investigación no sería posible.

Materials

70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22363548 Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting
ACH-2 Cells NIH 349 HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4
BD FACSAria BD Biosciences N/A Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)
BD LSRFortessa X-20 BD Biosciences N/A  Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)
Bronchoscope Olympus BF-1TH190  EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm
Cell Disassociation Solution Sigma C5914  Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.
CD169  BB515 BD Biosciences 565353 Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry
CD14  BV786 BD Biosciences 563698 Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry
CD206  PE BD Biosciences 555954 Mannose receptor antibody used for flow cytometry
CD3  Alexa700 BD Biosciences 557943 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD4  PE-Cy5 BD Biosciences 555348 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD45  PE Cy-7 BD Biosciences 557748 Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry
CD8  BV605 BD Biosciences 564116 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CompBead Plus BD 560497 Anti-mouse  Ig, κ  and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry
DNase I Invitrogen 18068015 Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA
dNTP Set 100 mM Invitrogen  10297-018 Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418  Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells
EDTA Invitrogen AM9912 Used to stop Dnase I enzyme activity
FBS Wisent Bioproducts 080-150 Premium fetal bovine serum to supplement media
FcR Blocking Reagent, Human Miltenyi 130-059-901 Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies
FlowJo v10 FlowJo LLC N/A Flow cytometry analysis software used for all analyses
HLA-DR  BV650 BD Biosciences 564231 MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry
HyClone HEPES solution Fisher Scientific SH3023701 Buffer providing maintenance of physiological pH 
Live/Dead  APC-H7 Invitrogen L34975 Viability marker used for flow cytometry
Lymphocyte Separation Medium (LSM) Wisent Bioproducts 350-000-CL Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001 Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1°C/minute, the optimal rate for cell preservation
OneComp eBeads Invitrogen 01-1111-41 Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples
PBS 1X Wisent Bioproducts 311-010-CL Phosphate buffered saline for cell washing and staining
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene Axygen PCR-0104-C 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene
PerfeCTa qPCR ToughMix Quantabio 95112 2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates 
QiaAmp DNA Mini Kit Qiagen 51304 Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers
Rotor-Gene Q Qiagen 9001550 Real-time PCR cycler
RPMI 1640 1X Wisent Bioproducts 350-000-CL Cell culture media
Sterile Water Wisent Bioproducts 809-115-CL DNase, RNase & protease free
Superscript™ III One-Step RT-PCR System  Invitrogen 12574018 RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate
Taq DNA Polymerase  Invitrogen 18038-042 Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride
Transcription Factor Buffer Set BD Biosciences 562725 Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer
Trypan Blue Sigma T8154 Viability dye to count cells using haemacytometer 
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Salahuddin, S., Thomson, E., Méziane, O., Farnos, O., Pagliuzza, A., Chomont, N., Olivenstein, R., Costiniuk, C., Jenabian, M. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. J. Vis. Exp. (148), e59427, doi:10.3791/59427 (2019).
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