JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

Published: June 23, 2019
doi:
10.3791/59427
, , , , , , , ,
1Research Institute McGill University Health Centre, 2Department of Biological Sciences,Université de Québec à Montréal, 3Department of Microbiology & Immunology,McGill University, 4Department of Medicine, Division of Infectious Diseases,McGill University, 5Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal, 6Département de microbiologie, infectiologie et immunologie,Université de Montréal

Summary

אנו מתארים שיטה לעיבוד מכתשיים נוזל ששטיפה בהתאמה דם היקפי מאנשים כרוניים הנגועים באיידס על טיפול תרופתי להערכת מאגרי HIV ריאתי. שיטות אלה תוצאה של רכישת תאים CD4 T טהור מאוד מכתשי מקרופאגים שעשויים להיגרם לאחר מכן עבור immunophenotyping קלדה ו-DNA האיידס/RNA כימות על ידי תגובת שרשרת באולטרסאונד.

Abstract

ברונכוסקופיה היא הליך רפואי לפיו תמיסת מלח נורמלי מוזרק לתוך הריאות באמצעות ברונסקופ ולאחר מכן יניקה מוחל, הסרת ששטיפה ברונדושיים (BAL) נוזל. נוזל בל הוא עשיר בתאים ובכך יכול לספק “תצלום” של הסביבה החיסונית של הריאות. CD4 T תאים הם מאגרי HIV מאופיין הטוב ביותר, בעוד יש ראיות חזקות להציע כי מקרופאגים רקמות, כולל מכתשי מקרופאגים (AMs), גם לשמש מאגרים ויראלי. עם זאת, הרבה עדיין לא ידוע על התפקיד של AMs בהקשר של הקמת מאגר HIV ותחזוקה. לכן, פיתוח פרוטוקול לעיבוד נוזל BAL להשיג תאים שעשויים לשמש virological ואימונולוגיים בחני לאפיין ולהעריך את אוכלוסיות התאים וקבוצות המשנה בריאות הוא רלוונטי להבנת התפקיד של הריאות כמו HIV אגרים. להלן, אנו מתארים פרוטוקול כזה, העסקת טכניקות סטנדרטיות כגון צנטריפוגה פשוטה וזרימה cy try. התאים CD4 T ו-AMs לאחר מכן ניתן להשתמש עבור יישומים הבאים, כולל immunophenotyping קלדה ו-DNA HIV ו-RNA כימות.

Introduction

אחד האתגרים המשמעותיים ביותר מול תרופה לזיהום HIV היא הנוכחות של מאגר האיידס החבוי הגורם לריבאונד של פלזמה viremia בעקבות ההפרעה של טיפול תרופתי (אמנות)1,2. בעוד מאגר ה-HIV במהלך לטווח ארוך אמנות מתועדת היטב בכמה תאי רקמה, כולל איברי הלימפה המשני, הבטן הקשורה רקמת הלימפה (גולט), ואת מערכת העצבים המרכזית (CN), הריאות כבר התעלמו כאזור המחקר מאז התקופה הקדם-אמנותית3. עם זאת, הריאות לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של HIV. אכן, הסימפטומים הריאתי היו בין האינדיקטורים הראשונים של הקשורות איידס זיהומים אופורטוניסטים4. גם בעידן האמנות המודרנית, אנשים עם HIV נמצאים בסיכון גבוה יותר לפתח מחלות ריאות זיהומיות ולא זיהומיות מאשר אנשים ללא HIV. לדוגמה, אנשים עם זיהום HIV נמצאים בסיכון מוגבר לזיהום דלקת ריאות streptococcal פולשנית, כמו גם מחלת ריאות חסימתית כרונית (copd)5,6. יתר על כן, זיהום coinfection שחפת (TB) ו-HIV הוא אתגר בריאות הציבור משמעותי באזורים מסוימים של העולם, בעיקר, אפריקה שמדרום לסהרה, כמו אנשים נגועים באיידס הם 16 עד 27 סביר יותר להיות שחפת מאשר אנשים ללא HIV7. למרות כמה הסברים על הרגישות הזאת לזיהום ריאתי ומחלה כרונית הוצעו8,9,10, מנגנונים סלולריים מדויקים שבהם אנשים עם HIV מודחק העומס פלזמה ויראלי להישאר בסיכון גבוה יותר עבור סיבוכים ריאתי לא הובהר לגמרי. חשוב מכך, HIV הוא גורם סיכון חזק מאוד לזיהום ריאתי מחלה כרונית, ללא תלות בסטטוס עישון6.

הניתוח של הסביבה החיסונית של הריאה הוא, לכן, חיוני כדי להבין את תפקידה בבריאות ומחלות. למרות שאינם פולשני, דגימות רוק המושרה נוטים להכיל כמויות גדולות של תאים אפיתל ופסולת עם לימפוציטים ריאתי נדיר ולא AMs, הגבלת תפקידם יישומים ספציפיים. לעומת זאת, לא ניתן להשיג ביופסיות גדולות של רקמות בהיעדר חשד למחלה עקב הסיכונים הכרוכים בדימום ובחזה האוויר המשמעותי (קריסת הריאה). יתר על כן, רוב התאים החיסוניים הריאתי ממוקמים בעיקר ברמה רירית שבו הריאות מגורה ברציפות על ידי אנטיגנים במהלך הנשימה. לשם כך, ברונכוסקופיה להשגת נוזל BAL יש את היתרון של מתן גישה בטוחה יחסית לימפוציטים ו-AMs (ראה איור 1). מקרופאגים מהווים את החלק הגדול ביותר של תאים בתוך נוזל BAL, ואחריו לימפוציטים11. היא שימושית, לפיכך, כדי ליצור שיטה שבאמצעותה ניתן לעבד את הנוזל BAL לשימוש ביישומים הבאים, כגון מסוג immunophenotyping קלדה, תרבית תאים, טרנססקריפט או כל יישום נוסף. הפרוטוקול לעיבוד הנוזל BAL המתואר כאן מותאם מהליכים כלליים שתוארו בעבר ממוטב עבור הזרם השונים במורד שונים המועסקים. מתודולוגיה זו מאפשרת בידוד של שני הלימפה הריאתי ואת התאים מיאלואידית רירית החיסונית שלהם והאפיון פונקציונלי, כמו גם הערכה של מאגר ה-hiv אצל מבוגרים החיים עם HIV.

כדי לבסס פרוטוקול זה, השתמשנו בקריטריונים הבאים כדי לגייס את משתתפי המחקר15. עבור המשתתפים להיות זכאים להשתתף במחקר זה, הם היו צריכים להיות אנשים נגועים באיידס שנפגשו הקריטריונים הבאים: (1) על אמנות לפחות 3 שנים; (2) מדוכא מטען נגיפי (VL) למינימום של 3 שנים; (3) ספירת תאים CD4 T של ≥ 200/mm3; (4) מוכן לעבור מחקר ספירומטריה וברונכוסקופיה. חולים עם הקריטריונים הבאים לא נכללו במחקר: (1) התוויות של ברונסקופיה; (2) הסיכון לדימום גבוה: הקואגופתיה או על וורפרין או טיפול קלופידוגרל; (3) תרומבוציטופניה (טסיות נמוך); (4) זיהום ריאתי פעיל או בתהליך אחר של שבלול אקוטי; (5) הריון/מנסה להיכנס להריון.

Protocol

פרוטוקול מחקר זה הוקם ישירות על בסיס העקרונות הכלולים בהצהרת הלסינקי וקיבל אישור מלוחות סקירה מוסדית של מרכז הבריאות של אוניברסיטת מקגיל (RI-MUHC,15-031), אוניברסיטת האוניברסיטה הבין לוקסמבורג מונטריאול (ה602) ומרכז העיר אשפוז דה מונטריאול (CR-צ’אם,15-180). 1. ברונשיים ששטיפה הערה: סעיף זה מתאר ברונכוסקופיה כפי שבוצעה על-ידי respirologist מורשה עם סיוע ממטפל נשימתי16,17. הכן את פיסות המנגנון הדרושות להליך, כולל ברונסקופ ותמיסת מלח. מנהל תרסיס הרדמה. לאחורי גרונו של המטופל הימנע שימוש מופרז בהרדמה מקומית כאשר הדבר אפשרי. החלת הלב מוביל לחזה על מנת לפקח על קצב הלב וקצב ובדיקת חמצן לאצבע הראשונה של יד כדי לפקח על רוויית החמצן. הכנס צינורית באף לתוך הנחיריים כדי לספק חמצן משלים. מקמו את המטופל, רצוי בתנוחת פרקדן. מנהל הרגעה כדלקמן: midazolam 0.01-0.04 mg/ק”ג ו פנטניל 50-100 μg (כדי להקל על נוחות המטופל ולמזער רפלקס שיעול) באופן מידי, בנוכחות של respirologist או מורדם. מראש את הסימפרונסקופ הגמיש עד שהוא נתקע בתוך הסמפון הרצוי. להחדיר תמיסת מלח (50-60 mL בכל פעם) עם המזרק, ולאחר מכן להחיל יניקה עדינה (50-80 mmHg). נוזל השטיפה יאסוף את המזרק. ויועבר למיכל איסוף חזור על הריקון לסכום כולל של 200-300 מ ל של ששטיפה. לאסוף לפחות 100 mL של נוזל BAL אם אפשר. מניחים את הנוזל BAL על הקרח. 2. בידוד של תאי בל הערה: ההליך הבא חייב להתבצע בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי, class II (BSL2) או גבוה יותר. שמרו את דגימות בל על הקרח עד שיעובדו. המערבולת בל בצינור האוסף המקורי ולהעביר אותו לצינור 50 mL באמצעות פיפטה סרוולוגית. אם נוזל BAL מופיע מאוד נחל דלוח או מזוהם על ידי רקמה filamentous, לסנן את הנוזל באמצעות מסנן רשת מדומה 70 יקרומטר שינוי לתוך צינור חדש 50 mL. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטנט לשפופרת חדשה 50 mL. בעדינות לשבור את הגלולה עם טיפ פיפטה ולהשעות אותו מחדש 1 מ ל של RPMI 1640 בינונית. העבר 1 מ ל של supernatant לכל אחד 10x 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה מיקרו ושאר supernatant ל 15 מ”ל צינורות, 10 מ ל בכל אחד. אחסן את כל צינורות הסופרנטאנט ב-80 ° c. עבד את הגלולה של תא בל. השהה מחדש את הגלולה ב-10 מ”ל של RPMI 1640 עבור כל 25 מ ל של המדגם המקורי. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש של 15 מ ל (למחוק לאחר להבטיח שיש מספיק תאים בגלולה). השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של RPMI 1640 + 10% סרום העובר (FBS) ולספור באמצעות טריקון כחול ו-הומוציטומטר.הערה: אם נוזל BAL אינו מופרד על-ידי הדבקות של תאים לפני המיון, המשך לסעיף 4. 3. דבקות בתאי בל (אופציונאלי) הערה: ניתן לבצע פרוטוקול חלופי זה לפני או במקום מיון התא. ההליך הבא חייב להתבצע תחת תנאים סטריליים בארון BSL2 (או יותר). העבר את המספר הרצוי של תאים BAL למיון חדש 15 מ”ל צינור וליצור את הנפח הנכון עבור 1.5 x 106 מקרופאגים/mL. צלחת 2 מ ל של תאים לכל טוב ב 6-היטב צלחות ו-דגירה עבור 2 h ב 37 ° צ’ עם 5% CO2, כדי לאפשר הזמן לדבקות. בעקבות הדגירה, מכילים בזהירות את המדיה המכילה תאים שאינם מחסיד ולהעביר אותו לצינור 15 מ ל. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הסר את הסופרנטאנט והשהה אותו מחדש ב-1 x 107 תאים/mL בתמיסת מלח באגירה (PBS) + 2% fbs והעבר את ההשעיה ל-5 מ ל פוליסטירן מוקצף עגול. שבר זה לימפוציטים הוא כעת מוכן כתם למיון התא. לתאי חסיד שנותרו בצלחת, להוסיף 1 mL לכל הטוב של פתרון שיוך תאים (לראות את הטבלה של חומרים) ו הדגירה עבור לפחות 15 דקות ב 37 ° c עם 5% CO2, עד התאים נפרדים בקלות מהצלחת עם טיפ פיפטה. בעדינות אבל לגרד ביסודיות את התאים החסיד מהמשטח היטב באמצעות מסכת פיפטה, ולהשתמש 1 mL של נוזל בבאר כדי לסייע עם הניתוק. העבר את התאים לצינור. שפופרת חדש של 15 מ ל שטוף את הבארות עם 1 מ ל של PBS ולהוסיף את זה לאותו צינור. הפוך את התוכן של הצינור ל 5 מ ל עם PBS. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות at RT. הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש ב-1 x 107 תאים/mL PBS + 2% fbs, והעבר את ההשעיה ל 5 מ ל פוליסטירן מוקצף עגול. שבר מיאלואיד זה מוכן כעת להכתים את מיון התא. 4. בידוד תאים היקפיים לתאי דם מונמונומנט הערה: ההליך הבא חייב להתבצע תחת תנאים סטריליים בארון BSL2 (או יותר). באותו יום של ברונסקופיה (בדרך כלל ישירות לפני האוסף בל), להשיג שש שפופרות של דם ורידים מתורם ב ethylenediamהחומצה (EDTA) צינורות (כ 10 מ”ל לצינור). הפרד את הדם על-ידי תפרידו את צינורות הדם ב 300 x g עבור 15 דקות ב RT. העברת פלזמה כדי 1.5 ml צינורות מיקרוצנטריפוגה ב 1 mL לאחסן את זה ב-80 ° c. ביצוע הפרדת מעבר הצבע בצפיפות. הוסיפו 2 מ ל של RPMI 1640 לכל צינור דם וערבבו היטב בעזרת פיפטה סרוולוגית. העבר ל 3x 50 מ”ל צינורות וליצור את הנפח בכל צינור ל 25 mL עם RPMI 1640. הכינו עוד אצווה של 3x 50 מ”ל צינורות, כל אחד המכיל 20 מ ל של בינונית הפרדה לימפוציטים (LSM) (לראות את הטבלה של חומרים) ב RT. לאט ובעדינות שכבה 25 מ ל של דם מדולל על גבי lsm עבור כל אחד משלושת הצינורות, מחזיק את הצינור בזווית 45 ° . צנטריפוגה ב 600 x g עבור 25 דקות ב-RT עם האצת נמוכה ולא להאט (הבלם את). בצעו כביסה של תאי דם היקפיים (PBMCs). העבר את שכבת התאים בממשק של שני השלבים הנוזליים בצינור לצינור 50 mL באמצעות פיפטה סרוולוגית; אם יש יותר מ 30 מ ל של נפח, לחלק אותו לשתי שפופרות. הפוך את העוצמה בכל צינור ל 50 mL עם PBS. צנטריפוגה ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT ולהסיר כמו supernatant ככל האפשר. השהה מחדש את הגלולה והפוך את הנפח ל -25 מ ל עם PBS. צנטריפוגה ב 350 x g עבור 10 דקות ב-RT ולהסיר כמו supernatant ככל האפשר. חזור על שלב השטיפה המתואר בשלב 4.4.3. השהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל של PBS + 2% FBS וספור את התאים. 5. מיון תאי בל ומסכת PBMCs הערה: ההליך הבא חייב להתבצע תחת תנאים סטריליים ב BSL2 (או יותר). הכן מאגר מיון המכיל PBS + 5% FBS + 25 מ”מ HEPES (pH 7.4). הכינו 5 מ ל פוליסטירן מוקצף עם 2 מ ל של FBS לאוסף של ערכות משנה של תאים ממוינים. לבצע כתמים. הכינו מיכלי קלקר עגולים בעלי 3x 5 מ ל, כל אחד עבור בל (תאים שלמים או שברים מיאלואידים ולאחר הדבקות) ו PBMCs (ראה סעיף 4). עבור כל קבוצת משנה, להכין צינור אחד עם תאים למיין ושתי שתי שפופרות של 5 x 105 תאים להשתמש עבור מוכתם והכדאיות שולטת פיצוי הכתם. צנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטנים, השהה מחדש את התאים עבור פקדים ב-100 μL של PBS ואחסן אותם ב-4 ° צ’ עד שניתן יהיה להכין את פקדי הפיצוי כמתואר בשלב 5.2.6. להכין 1:20 דילול של קולטן Fc (FcR) חסימת מגיב ב-PBS + 5% FCR (לראות את הטבלה של חומרים-כדי למנוע את הקשירה הלא ספציפית של נוגדן ל fcr על התאים fcr-ביטוי). השהה מחדש את התאים כדי למיין אותם ב-1 x 107 תאים ב-250 μl של תערובת חוסמת fcr. מודאת אותם בשביל 1. ב -4 ° c לאחר הדגירה, להוסיף את קוקטייל הנוגדן המתאים (לראות את הטבלה 1) על התאים ואת הדגירה עבור 1 h ב 4 ° c בחושך. אחרי 1 h של כתמים, להוסיף 1 mL של PBS לתאים וצנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את התאים החוזרים והשהה מחדש במאגר המיון כדי להיות בעלי 1 x 107 תאים ב-250 μl. סנן את התאים באמצעות מסנן של 70 יקרומטר במידת הצורך. הכן פקדי פיצוי. הוסף שלוש טיפות כל אחד אנטי עכבר Ig, κ, ושלילי מחרוזת פיצוי בקרה (לראות את הטבלה של חומרים) ל 1 מ ל של PBS בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה ולהעביר 100 μl לכל 5 מ ל שפופרת קלקר עגול-התחתית כדי לשמש פיצוי. הכינו צינור אחד עבור כל fluorochrome הנוכחי בקוקטייל כדי לשמש. הוסף 1 μL של כל נוגדן בקוקטייל לצינורית שונה המכילה חרוזים. הוסף 1 μL של כתם הכדאיות לאחד הצינורות של 5 x 105 תאים להגדיר בצד בשלב 5.2.1. דגירה של 20 דקות ב 4 ° c בחשיכה. הוסף 1 mL של PBS לכל צינור ו צנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-250 μL של PBS. החנות ב -4 ° c בחשכה עד הצורך. מיין את התאים על ידי מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) לתוך צינורות אוסף מוכן 1 מ ל של FBS ו מערבולת בעדינות לחלוק את הצדדים של צינורות עם סרום. מיון תאים באל בלחץ נמוך. תאים השער הראשון להוציא את הרעש וכוללים חי, CD45+ תאים, ובתוך האוכלוסייה הזאת החוצה מחוץ לתאים (ראה איור 3). בתוך מיון האוכלוסיה המייאלואידית הגדולה CD206 ו CD169 כפול תאים חיוביים כ-AMs; בתוך אוכלוסיית לימפוציטים קטנים יותר לבודד CD3+ תאים ולמיין הן CD4 וCD8 אוכלוסיות חיוביות בודדות (ראה איור 3; המשך אסטרטגיה המפורטת בסעיף התוצאות המייצג). בעת מיון PBMCs, השער התאים הראשון כדי להוציא רעש וכוללים live, CD45+ תאים, ובתוך האוכלוסייה הזאת החוצה מחוץ לתאים. לאחר מכן, שער על תאים CD3 ובתוך CD3- האוכלוסיה, השער הראשון על CD14 ולמיין מונוציטים חיובי יחיד, ולאחר מכן בתוך the CD3+ שער האוכלוסייה על CD4 ו-CD8 ולמיין גם אוכלוסיות חיוביות בודדות (לאחר אסטרטגיה המפורטת ב סעיף ‘ תוצאות מייצגות ‘. 6. immunophenotyping קלדה של AMs ו PBMCs הערה: ההליך הבא חייב להתבצע תחת תנאים סטריליים בארון BSL2 (או יותר). הוסיפו עד 1,000,000 כל אחד מ-AMs ו-PBMCs לשתי שפופרות של 5 מ ל בעלי תחתית עגולה. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהסיר את הסופרנטאנט. בצע חסימת FcR כדי לשפר את הספציפיות של כתמים נוגדן. בשביל זה, להשעות מחדש את התאים ב-100 μL של PBS + 2% FBS ולהוסיף 1.4 μL של Fbs חסימת מגיב. דגירה של 20 דקות ב 4 oC. לבצע כתמים מסחטות. בעקבות הדגירה עם FcR לחסום, להוסיף את הקוקטייל הרצוי הנוגדן החילוץ, מערבולת את הצינורות, ו-דגירה עבור 1 h ב 4 ° c בחושך. לשטוף 2x על ידי הוספת 500 μL של PBS ו תפרידו ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. היכונו לקיבוע ולחדירות (ראו את הטבלה של חומרים לריאגנטים ספציפי). להכין פתרון חדירות עם מאגר חדירות חלק 1 ו 3 חלקים מאגר דילול. להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של פתרון החדירות ואת הדגירה עבור 40 דקות ב 4 ° c בחושך. להכין את הפתרון לשטוף באמצעות מאגר שטיפת חלק 1 ו 4 חלקים H2O. Add 2 mL של הפתרון לשטוף את התאים החדירות ואת צנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . הסר את הסופרנטאנט לבצע כתמים תאיים. השהה מחדש את התאים ב-100 μL של הפתרון לשטוף 1x, להוסיף את הנוגדנים הרצוי תאיים, מערבולת את הצינורות, ו מודחלת עבור לפחות 1 h ב 4 ° c בחושך. הוסף 2 מ ל של כביסה פתרון וצנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות ב RT. הסר את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 200 μl של PBS. אחסן את התאים ב -4 ° c בחשכה עד לצורך. 7. שארית של תאי בל הערה: ההליך הבא חייב להתבצע תחת תנאים סטריליים בארון BSL2 (או יותר). מספרי התאים מאפשר, הקפאה של תאים חיים מתוך הגלולה בל תא (משלב 2.2.2). הכינו מדיה הקפאה המכילה 90% FBS + 10% diמתיל סולפוקסיד (DMSO). צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. הסר את supernatant ולהשעות מחדש ב 1.5 mL של הקפאת מדיה בבקבוקון קריוגני. העבירו את מבחנות הקריוגניים למיכל הקפאה בקצב מבוקר (ראו את טבלת החומרים) והניחו אותם ב-80 ° c. העבר את התאים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך לאחר הגעת הטמפרטורה. לשמר את התאים בל כמו כדורי יבש. העבר את התאים הנותרים לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. צנטריפוגה בצנטריפוגה העליון הנגדי ב 6,000 x g עבור 1 דקות. הסר את הכמות הרבה ככל האפשר מבלי להפריע לגלולה. אחסן את הגלולה ב-80 ° c. 8. האיידס DNA ו-RNA הקוונפיקציה הערה: ההליך הבא חייב להתבצע תחת תנאים סטריליים בארון BSL2 (או יותר). סה כ כימות דנ א של HIV כדי למנוע עיכוב של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) עם פסולת BAL lysate להשתמש בערכת החילוץ DNA (לראות את הטבלה של חומרים) כדי לחלץ דנ א ממדגם של תאים BAL על פי הוראות היצרן. השתמש 15 μL של ה-DNA הזה בשילוב עם מיקס מאסטר בשלב הגברה המתואר להלן (שלב 8.1.3). הכינו מדלל עיקול סטנדרטיים. כמו לעיל, להשתמש בערכת החילוץ DNA כדי לחלץ DNA מתוך גלולה של 2 x 106 ACH-2 תאים (לראות את הטבלה של חומרים). לאחר הימנעות של ה-DNA, לבצע מדלל סדרתי 10-מקפלים של ה-DNA ACH-2 כדי ליצור שישה דילול, החל 3 x 105 תאים כדי 3 תאים לכל 15 μl. בצע צעד הגברה מראש. בחדר נפרד, להכין את התמהיל הראשי עבור n + 2 דגימות הכוללת מאגר 1 x פולימראז, 3 מ”מ של MgCl2, 300 Μm dntps, ו 2.5 U של taq DNA פולימראז (לראות את הטבלה של חומרים) ו 300 nM של כל אחד מארבעת הצבעי היסוד (ראה step 8.1.3.2). בצע את כל האמצעים בבארות שלישיה. השתמש התחל hCD3OUT5 ‘, hCD3OUT3 ‘, ULF1, ו UR1 לייצר דנ א מוגבר משני הCD3 האנושי ו-HIV (לראות את הרצפים בטבלה 2). שים לב כי שני הגנים הם מוגבר באותה צינורית. מערבבים בעדינות ומסתובבים בצינור כדי להבטיח ערבוב מלא. הפץ 35 μL של ערבוב מאסטר לכל טוב בצלחת 96-היטב PCR ולהוסיף 15 μL של תקן או DNA לדוגמה. נפח התגובה הכולל הוא 50 μL. בצע את הגברה (הדנטורציה ב-95 ° c למשך 8 דקות, ואחריו 12 מחזורים של 95 ° צ’ במשך 1 דקות, 55 ° צ’ עבור 40 s, 72 ° c עבור 1 דקות, והתארכות ב-72 ° c עבור 15 דקות). לבצע PCR בזמן אמת. כדי לכמת CD3 ו-DNA HIV, להכין שני תערובות הורים המכילים 1 x PCR התגובה לערבב מאסטר (לראות את הטבלה של חומרים), 1,250 ננומטר מתאים התחל, ו 100 המחקר nm. השימוש התחל HCD3IN5 ‘ ו HCD3IN3 ‘ ו בדיקה CD3 FamZen לכמת האדם CD3 בתגובה אחת, ו התחל UR2 ו למאובאט ובדיקה UHIV FamZen כדי לכמת את ה-DNA HIV בתגובה אחרת (לראות את הרצפים בטבלה 2). הפץ 13.6 μL של כל שילוב בצינורות המותאמים ל-qPCR. דלל את מוצר ה-PCR המגברה ב-1:10 במים סטריליים, DNase, RNase, ו פרוטאז חינם. הוסף 6.4 μL של כל מדגם מדולל כדי 13.6 μL של מיקס qPCR בצינורות בהתאמה qPCR עבור נפח התגובה הכולל של 20 μL. לבצע את ה-PCR בזמן אמת באמצעות התוכנית הבאה: הדנטורציה ב 95 ° c עבור 4 דקות ו 40 מחזורים של 95 ° c עבור 3 s 60 ו-c מעלות צלזיוס עבור 10 עם רכישה אחת. לשער את מספר עותקי ה-HIV ואת המקבילה תא מספר בכל שפופרת התגובה מפני עקומות סטנדרטיות. חשב את מספר עותקי ה-DNA של HIV/106 תאים. כימות האיידס לחלץ רנ א ממדגם של תאים BAL, באמצעות ערכת החילוץ RNA (לראות את הטבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן. השתמש 17 μL של RNA זה בתעתיק הפוך וצעד מראש המתואר להלן (שלב 8.2.4). שימוש משמאל למטה RNA מסונתז בתוך מבחנה וככמת בדיוק משמש כסטנדרט; זה מחודדים לתוך התורם בריא RNA לתמצית עבור נורמליזציה GUSB. הכינו שישה מדלל מקפלים 10 סדרתי של תקן זה, המתאים ל-3 x 105 תאים לשלושה עותקים של RNA משמאל לימין ב -17 μl. הפץ 17 μL של כל דילול סטנדרטי כל מדגם בצלחת 96-היטב PCR ולטפל בדגימות עם DNase (לראות את הטבלה של חומרים) עבור 10 דקות ב 25 ° צ’ כדי להסיר דנ א זיהום גנומי. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 2 μL של 25 מ”מ EDTA ו מארג את הדגימות עבור 10 דקות ב 65 ° c. לבצע תמלול הפוכה (RT) ו-PCR הגברה. בצע שלב זה באמצעות ערכת RT-PCR בצעד אחד (עיין בטבלת החומרים) לפי הוראות היצרן. השימוש התחל GUSB קדימה 1, GUSB הפוכה 1, UR1, ו ULF1 כדי ליצור cDNA מוגבר משני GUSB האנושי כמו גן שירות ומלא משמאל האיידס-RNA (ראה רצפים בטבלה 2). ערכי GUSB ישמשו לנרמול ערכי ה-HIV. הפץ 31 μL של ערבוב מאסטר לכל טוב באותה צלחת 96-הטוב PCR המכיל את התקנים ודגימות DNase מטופלים ומערבבים היטב. נפח התגובה הכולל הוא 50 μL. הפעל את הצלחת 16 מחזורים לפי הוראות היצרן, עם טמפרטורת ריפוי של 55 ° c. לבצע PCR בזמן אמת. הכינו שני תערובות מאסטר המכילות שילוב מאסטר של התגובה 1 x PCR (כאמור לעיל בשלב 8.1.4.1), 1250 ננומטר המתאים לתחל, ו 100 בדיקה nM. השימוש התחל GUSB הקדמי 2, GUSB הפוכה 2, ו בדיקה GUSB-HEX לכמת GUSB cDNA בתגובה אחת; השימוש התחל UR2, לאמאט, ובדיקה UHIV FamZen לכמת HIV cDNA בתגובה אחרת (לראות את הרצפים בטבלה 2). הפץ 13.6 μL של כל תמהיל בסיס בצינורות המותאמים ל-qPCR. לדלל את מוצרי ה-PCR מראש מוצרים 1:10 במים סטריליים, DNase, RNase, ו פרוטאז חינם, ולהוסיף 6.4 μL של כל מדגם מדולל או סטנדרטי לערבב PCR המתאים. נפח התגובה הכולל הוא 20 μL. לבצע את ה-PCR בזמן אמת באמצעות התוכנית הבאה: הדנטורציה ב 95 ° צ’ עבור 4 דקות ו 40 מחזורים של 95 ° c עבור 3 s 60 ו-c ° צלזיוס עבור 10 עם רכישה אחת (בחר את הערוץ הירוק עבור FamZen ו צהוב עבור HEX).

Representative Results

ברוב שאינם מעשנים, נוזל BAL מתקבל במיכל סטרילי והוא נוזל בצבע צהוב כתום במקצת. הנוזל עשוי להיות פינקר בצבע אם התורם עבר ביופסיה אנדוסימפונות במהלך הסימפכוסקופיה וקצת דימום אירע. הנוזל עשוי להיות כהה יותר בצבע אם התורם הוא מעשן. לאחר צנטריפוגה, BAL supernatant יהיה כמעט ברור וכתום מעט, בעוד הגלולה התא יכול לנוע בצבע מחוץ ללבן כדי חום כהה מאוד, בהתאם למצב של המדגם והאם התורם היה מעשן או לא. כאשר סופרים את כל המדגם BAL, סוגי תאים שונים יכולים להיות דמיינו, כולל גדול יותר, עגול מקרופאגים סביב 17 יקרומטר קוטר ולימפוציטים עגולים קטנים יותר סביב 7.3 יקרומטר בקוטר18,19 (ראה איור 2). מקרופאגים מוגדלים למעשנים על ידי כ 40. ההבחנה בין סוגי תאים מאפשר לספור את מקרופאגים ו לימפוציטים בנפרד. ייתכנו גם כמה פסולת לראות בשדה, במיוחד בדגימות של מעשנים. מקרופאגים הם סוג תא שופע ביותר באל, חשבונאות עבור כ 85% של תאים בלתי מעשנים20, והם מועשר מעשנים כך שהם עשויים להיראות כמעט בלעדית. תאים בל יש נטייה צבירה, כך הם חייבים להיות מעורבים היטב במהלך כל המניפולציות. הגלולה עשויה להיראות כהה גם לאחר כמה צעדים לשטוף. אם פסולת filamentous ניכרת בשבר לאחר צביעת למיון תא, להעביר את התאים באמצעות מסנן 70 יקרומטר לפני הפעלת אותם דרך סדרן התא. המיון של תאים BAL חייב להיעשות בלחץ נמוך כדי להבטיח גדלי droplet גדול מספיק כדי להתאים את מקרופאגים. התאים מגודרת תחילה לכלול את כל CD45+21 תאים, ולאחר מכן מבוסס על כדאיות כדי להבטיח את כל התאים מתים אינם נכללים (ראה איור 3). התאים סינגאז נבחרו ובתוך זה, שתי אוכלוסיות מגודרת מבוסס על גודל מורפולוגיה, כלומר תאים מיאלואידית גדול יותר לימפוציטים קטנים יותר (ראה איור 3). בתוך התאים הגדולים, תאים מגודרת על CD20622,23 ו CD16922 ואת התאים כפול חיובי ממוינים כמו AMs, בעוד בתוך התאים הקטנים, CD3+ תאים נבחרים ומגודרת על CD4 ו CD8; CD4 תאים חד-חיוביים וCD8-חיוביים בודדים ממוינים (ראה איור 3). הסמנים בשימוש נבחרו על בסיס הפנוטיפים שתוארו בעבר של AMs, כגון קולטן האף מנוז CD206, נמצא על תאים phagocytic23, ואת הקולטן sialo החטא CD16922. בשעת מיון PBMCs, התאים מגודרת תחילה על גבי פיזור בצד הקדמי, אשר צריך להציג אוכלוסיית לימפוציטים אחידה, כולם נלקחים, למעט רעש קרוב לציר אפס (נתונים לא מוצגים). האוכלוסייה מגודרת על כדאיות ו CD45, ולחיות CD45+ תאים משמשים. אוכלוסייה זו מגודרת אז על CD3; כדי לבודד את המונולוציטים, האוכלוסיה CD3 מגודרת לאחר מכן ב- CD14 וכל התאים החיוביים היחידים ממוינים. כדי לבודד תת-ערכות לימפוציטים, התאים CD3+ מסודרים בCD4 ובCD8 ואוכלוסיית התאים החיובית היחידה ממוינת. איור 1 : מבט כולל על פרוטוקול. סכימטי המציג את זרימת העבודה של הפרוטוקול, כולל השימוש הפוטנציאלי במורד הזרם של דגימות שנוצרו. PBMC = דם היקפי תאים מונחדרורים; בל = ששטיפה ברונשיים; LSM = מדיום הפרדה לימפוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2 : שדה מיקרוסקופ תצוגה של נוזל שלם בל. מיקרוסקופ תמונות מ (א) ללא מעשן ו (ב) מעשן עם לימפוציטים גלויים (L), מקרופאגים (M), ותאי דם אדומים (rbc). ההגדלה היא 1, 000x (עדשה 10x ועדשת 100x עם טבילה בשמן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3 : הנציגה באסטרטגיה למיון התא של תאי BAL שלמים. האסטרטגיה המשמשת למיון מכתשי, מקרופאגים (AM), CD4 וCD8 T מדגימות שלמות של תאי בל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. דוגמה נוגדן פלואורוכרום שיבוט אמצעי אחסון לבדיקה (μL) בל ו-PBMC חי/מת APC-H7 – 1 CD45 PE-Cy7 HI30 מיכל 5 CD3 Alexa700 UCHT1 2 CD4 PE-cy5 RPA-T4 4 CD8 BV605 SK1 3 בלבד CD206 PE 19.2 10 CD169 BB515 7-239 מיכל 5 PBMC בלבד CD14 BV786 M5E2 מיכל 5 טבלה 1: לוח זרימה למיון של תאי BAL שלמים ומבודדים PBMCs. יעד צעד שם תחל פריימר סדרה HIV סה כ DNA או HIV משמאל למטה RNA הגברה מראש UR1 5 ‘-אמנות עכשווית TCT CTC TCT TTC תג C-3 ‘ ULF1 5 ‘-ATG אמנות עכשווית CGT AAG CGT מעבד AAC TCT GGG TCT CTC TCT טה GAC-3 ‘ PCR בזמן אמת UR2 5 ‘-CTG AGG גת CTC תג טה CC-3 ‘ למדת ‘ 5 ‘-ATG אמנות עכשווית CGT AAG CGT AAC T-3 ‘ : משפחה 5 ‘-/56-FAM/CA CTC AAG G/זן/C AAG CTT למעלה/3 ‘ דנ א CD3 הגברה מראש HCD3 5 ‘ 5 ‘-הפעל GAC ATG גה הקאג הג AAG-3 ‘ HCD3 3 ‘ 5 ‘-אמנות עכשווית GCT CTG התגית GCT ACA-3 ‘ PCR בזמן אמת HCD3 בתוך 5 ‘ 5 ‘-GGC החתול TCT TCT TCT AGG T-3 ‘ HCD 3 ב 3 ‘ 5 ‘-CCT CTC TTC חתול טה AGC A-3 ‘ CD3 משפחה: 5 ‘-/56-FAM/AG הקאג אגא A/זן/C AGT TAA מחסום CCT אמנות עכשווית T/3, 3 ‘ המנון בלבד הגברה מראש GUSB קדימה 1: 5 ‘-תג ACC AAT CTG CTG פעולה A-3 ‘ היפוך GUSB 1: 5 ‘-GTT הסוכנות האווירית למזגן גת C-3 PCR בזמן אמת GUSB קדימה 2: 5 ‘-TGC TGC CTA CTA CTA גה גת G-3 ‘ היפוך GUSB 2: מחבר 5-תג A-3 ‘-CCT GUSB-HEX: 5 ‘-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 ‘ שולחן 2: פריימר ורצפים בדיקה עבור האיידס DNA ו-RNA הקוונפיקציה.

Discussion

כאן תיארנו שיטה לעיבוד נוזל BAL כדי להשיג CD4 T תאים AMs, לצד PBMCs התאמה, אשר ניתן ללמוד לחקור את מאגר ה-HIV בתוך הריאות. אנו דיווחו לאחרונה על כימות ה-DNA של HIV בתאי CD4 T מתוך דם היקפי ודגימות BAL, והקבוצה שלנו הפגינו כי HIV הוא 13 פעמים שופע יותר בתאי הריאות CD4 T מאשר אלה של דם היקפי15. עם זאת, רמות ה-DNA של HIV ב AMs הם התורמים תלוי ולכן, עד כה, לא היה מתאם עקבי בין רמות ה-DNA של האיידס בתוך לימפוציטים לעומת מקרופאגים15. הגישה לקבוצות המשנה הראשיות של תאים מקרופאג, עם זאת, יהיה כלי חיוני כדי לחקור את השאלה הזאת ולקבל הבנה טובה יותר של עומס ויראלי בריאה בהקשר של מאגר ה-HIV.

בתקופה שלפני האמנות ובמחקרים נוספים באמצעות נוזל BAL, המשתתפים עברו ברונכוסקופיה כדי לאבחן את החשד לפתולוגיה או לקבל אבחנה מיקרוביולוגית לתסמיני הנשימה3. עם זאת, הצלחנו לגייס משתתפים ללא כל תסמיני הריאות הפעילים או הפתווגיות, וכל המשתתפים חתמו על טופס הסכמה מוסרי15. הצלחנו לגייס משתתפים מהמרכז שלנו, אשר השתתפו במחקרים אחרים, כגון מחקר הקרנה מספירומטריה למחלת ריאות חסימתית24, כמו גם לאלה העוברים תהליכי מחקר אחרים, כגון לוקיהרזיס ו קולונוסקופיה. המחקר הקודם בקרב אנשים החיים עם HIV הוכיח כי אלטרואיזם הוא גורם מפתח מוטיבציה השתתפות במחקרים מחקר25. כמו עם הרבה דגימות אנושיות, ציינו הרבה מאוד השתנות אדם-לאדם. לא הייתה שום דרך “לנבא” מאילו משתתפים היינו משיגים את באל עם התשואות התאים הטובות לעומת העניים. שלא כמו דם היקפי, אשר מניב מספר עקבי למדי של לימפוציטים, מספרי התאים בנוזל BAL הם משתנים מאוד. הזרקת נפח גדול יותר של תמיסת מלח נורמלי לתוך הריאות (עם התקוות של קבלת תשואה גדולה יותר של נוזל BAL) הוא לא תמיד אפשרי כמו כמויות גדולות יותר של תמיסת מלח רגיל משויכים לעתים קרובות עם שיעול יותר סיכון גבוה יותר של משחת שלאחר חום. שמנו לב כי באמצעות ברונסקופ קטן (ולא גדול יותר) בקוטר מופעל הrespirologist להגיע עמוק יותר לתוך הברוצ ולקבל נוזל המכיל כמויות גדולות יותר של תאים. ממצא עקבי היה כי מעשנים טבק היו פרופורציות הרבה יותר גדול של AMs מאשר לימפוציטים בתוך נוזל בל שלהם, אשר צפוי כפסולת AMs המפרץ וחומר חלקיקי. יתר על כן, הבחנו כי נוזל BAL מעשנים הכיל פסולת אשר עשוי לחסום את הציוד המשמש, כגון מכונות PCR ו-cytomטומטריים זורמים. בעיות דומות ניתן לצפות באזורים של זיהום גבוה או אנשים חשופים בתדירות גבוהה יותר לאיכות האוויר המסכן.

ביחס לתפקידם בהקמת מאגרי HIV והתמדה ויראלית, הטוהר של CD4 T תאים ו-AMs הוא שיקול מפתח. מסיבה זו, אנו בחרו להשתמש במיון תא המופעל על ידי זריחה (FACS) כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהור ביותר. ייתכן גם כי נוזל BAL שנאסף עשוי להיות מזוהם עם דם כמו דימום קטין צפוי במהלך ברונסקופיה; הנוכחות של תאים תמימים B יציין את זה, ואת התאים ניתן לשטוף במאגר דם אדום הפירוק כדי לעקוף את הבעיה. אתגר נוסף עם לימוד נוזל BAL מתייחס לכמת סמנים דלקתיים ציטוקינים, אשר חשובים להבנת ההתמדה של HIV26. כמו מלוחים החדירו מדלל את הנוזל BAL, רמות של מגשרים דלקתיים וציטוקינים עשויים להיות קשה למדוד. למרות גורם תיקון אוריאה הוצע לחשבון עבור דילול, יש ספרות קטנה יחסית המתארת את השימוש שלה27,28.

AMs הם פלורסנט במיוחד, אשר מהווה בעיה במהלך מיון תאים וזרימה cy, לנסות בניתוח פנוטומי. בפרט, ההשפעה היא בולטת יותר מעשנים אשר AMs עשויים להיות שחור לחלוטין בצבע, המשפיעים באופן משמעותי על הקרינה האוטומטית שלהם. כאשר מתרגש על-ידי תקן כחול 488 ננומטר לייזר, AM autoפלואורסצנטית הוא בשיאו ב בקירוב כ 540 ננומטר, אשר חופף עם ספקטרום של זריחה של שערי מעלה נפוץ כגון fitc ו-PE29,30. ראוי לציין כי שני לייזרים נפרדים ניתן להשתמש כדי להלהיב FITC ו PE (למשל, PE על ידי צהוב/ירוק ו-FITC על ידי כחול 488 לייזר). כדי להתגבר על האוטוסונטית הפנימי עם FITC, השתמשנו בלתי מוכתם AMs כדי לקבוע את הרקע האוטומטי. בנוסף, השימוש של הזריחה מינוס אחד (FMO) בקרות יכול להיות מאוד שימושי כדי להילחם בנושאים טכניים אלה. מחרוזות גדולות יותר (למשל, 7.5 μm) ניתן להשתמש, אשר קרוב יותר בגודל עבור מקרופאג אוכלוסיות פיצוי, לעומת חרוזים קטנים יותר (למשל, 3.0 μm), אשר ניתן להשתמש בהם עבור אוכלוסיות לימפוציטים פיצוי. גישה מתאימה עוד יותר יהיה להשתמש בחלק קטן של תאים כמו שולטת כתם אחד, באמצעות סמן ידוע, ביטוי מאוד על קבוצת המשנה, כגון HLA-DR או CD45, מעלה באוב לכל את fluorochromes הרצוי, אשר תאפשר הרבה יותר פיצוי מדויק מאשר ניתן להשיג עם חרוזים. במקרה של מעשנים דגימות, טקטיקה זו היא שימושית במיוחד כמו מקרופאגים הם הרבה יותר גדול ואוטומטי יותר פלורסנט. בנוסף, משלב ההכנה, כל דגימת בל יכולה להיות תרבותית בצלחת לפני מיון כפי שמתואר בסעיף 3 לפרוטוקול, כדי לאפשר הפרדה בין האוכלוסיות בדבקות. בדרך זו, מקרופאגים חסיד יכול להיות מבודד מתאים אחרים שאינם חסיד כגון לימפוציטים. פיצוי הוא הרבה פחות מאתגר אם אוכלוסיית הלימפוציטים ו-AM מופרדים ולא נבדקת ביחד; עם זאת, הסתמכות על דבקות תגרום לאובדן של מקרופאגים, שהוא שיקול חשוב כאשר מספרי התאים כבר מגבילים. גם, צעד הדבקות יכול לגרום להפעלה לא רצויה של חסיד מונוציטים, אשר עשוי להשפיע על תוצאות במורד הזרם שנוצר באמצעות תאים אלה. הערך של ביעילות מיון תאים לאוכלוסיות טהור חייב להיות שוקלת נגד ההגבלה שיש פחות תאים כאלה לניסויים הבאים.

דגמים אחרים, בעיקר מודלים murine, שימשו כדי ללמוד מקרופאג אימונולוגיים המאפיינים וביולוגיה. בעוד מודלים אלה הם שימושיים מאוד ולאפשר תובנה גדולה לתוך סוג תא קשה לתמרן, יש להם מגבלות. רבים מסמני פני השטח של התאים משתנים בין עכברים לבני אדם, כך שהאימונואופטיטיפ של האדם אינו מובן לחלוטין. עם זאת, מערכת מודל זו דורשת צירוף של מספר עכברים עבור בחני בשל מספרי התאים הנמוכים הזמינים מכל בעל חיים. בנוסף, הצורך בדגימות של בריכות מונע שיקולים של נטייה גנטית ומין. לאחרונה, זה הוכח כי מין משחק תפקיד הנגועים של מקרופאגים על ידי HIV-1 בשל הביטוי שונים של פקטור ההגבלה SAMHD-131. פרימטים לא אנושיים (nhp) מייצגים את המודל הקרוב ביותר לבני אדם והקלה על המחקר של וירוס הכשל החיסוני קופיים (סיב) זיהום השפעתו על מערכת החיסון, מתן תובנה לתפקיד של מקרופאגים המתמחים ברקמות לעומת מקרופאגים הנגזרים מונוציט. ב רזוס קופי, זה הוכח גם כי הריאה מקרופאג מבודד BAL הנמל וירוס המוסמכת השכפול; שיטת הצמיחה הנגיפית (VOA) שימש לניתוח ההתנהגות של סיב בתאים שוכני-רקמות32. ממצא כזה הוא בעל ערך מחקרי משמעותי אך חייב להיות עדיין מאומת אצל בני אדם לפני שניתן יהיה להחילו, והעלות הגבוהה של שימוש ב-NHPs מונע את השימוש באוכלוסיות גדולות לדוגמה. בנוסף, ה-AMs האנושיים יהיו שימושיים ליישומים רבים אחרים, כגון בעלי מבחנה ויראלי/מיקרוביאלית של זיהום ובמחקרים של פתוגנים אחרים כגון שחפת/איידס.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר בתורמים שלהם: המכונים הקנדים לחקר הבריאות (CIHR) (הענק153082 לCC, רס ן, NC); הנגועים בצ סידה ומאלמת משתמשים בעלי כפות העור דה קוויבק (FRQ-S) שהעניק מימון ל-CC ו-רס”ן ולפקולטה לרפואה של אוניברסיטת מקגיל, אשר העניקה מימון ל-CC. מחקר זה נתמך גם בחלק המכונים הקנדיים של מחקר הבריאות (CIHR)-ממומן הקנדי לריפוי ארגוני HIV (יכול) צוות גרנט HB2 – 164064 ל-רס”ן, CC ו-NC. רס ן מחזיקה CIHR בראש המחקר קנדה ברמה 2 ב חיסוני והעתק ו-NC להחזיק FRQ-S זוטר 1 ו ג’וניור 2 פרס שכר מחקר, בהתאמה. ב-ET מתקיים פרס של מסעדת הארגון.

בנוסף, המחברים רוצים להכיר בחוסה Girouard ובכל העובדים הקליניים המעורבים בתיאום ובהשגת הדגימות, כמו גם במטפלים בדרכי הנשימה; קטרינה איניקוצ’נקו, הלן פלואה-ואיללט, ומארי-הלן לקובל בפלטפורמת ההקלדה החיסונית של RI-MUHC; וד ר מריאנה אורלובה לאספקת תמונות המיקרוסקופיה. והכי חשוב, המחברים רוצים להודות למתנדבים הרבים שבלעדיהם המחקר הזה לא יהיה אפשרי.

Materials

70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22363548 Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting
ACH-2 Cells NIH 349 HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4
BD FACSAria BD Biosciences N/A Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)
BD LSRFortessa X-20 BD Biosciences N/A  Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)
Bronchoscope Olympus BF-1TH190  EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm
Cell Disassociation Solution Sigma C5914  Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.
CD169  BB515 BD Biosciences 565353 Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry
CD14  BV786 BD Biosciences 563698 Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry
CD206  PE BD Biosciences 555954 Mannose receptor antibody used for flow cytometry
CD3  Alexa700 BD Biosciences 557943 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD4  PE-Cy5 BD Biosciences 555348 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD45  PE Cy-7 BD Biosciences 557748 Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry
CD8  BV605 BD Biosciences 564116 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CompBead Plus BD 560497 Anti-mouse  Ig, κ  and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry
DNase I Invitrogen 18068015 Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA
dNTP Set 100 mM Invitrogen  10297-018 Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418  Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells
EDTA Invitrogen AM9912 Used to stop Dnase I enzyme activity
FBS Wisent Bioproducts 080-150 Premium fetal bovine serum to supplement media
FcR Blocking Reagent, Human Miltenyi 130-059-901 Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies
FlowJo v10 FlowJo LLC N/A Flow cytometry analysis software used for all analyses
HLA-DR  BV650 BD Biosciences 564231 MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry
HyClone HEPES solution Fisher Scientific SH3023701 Buffer providing maintenance of physiological pH 
Live/Dead  APC-H7 Invitrogen L34975 Viability marker used for flow cytometry
Lymphocyte Separation Medium (LSM) Wisent Bioproducts 350-000-CL Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001 Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1°C/minute, the optimal rate for cell preservation
OneComp eBeads Invitrogen 01-1111-41 Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples
PBS 1X Wisent Bioproducts 311-010-CL Phosphate buffered saline for cell washing and staining
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene Axygen PCR-0104-C 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene
PerfeCTa qPCR ToughMix Quantabio 95112 2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates 
QiaAmp DNA Mini Kit Qiagen 51304 Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers
Rotor-Gene Q Qiagen 9001550 Real-time PCR cycler
RPMI 1640 1X Wisent Bioproducts 350-000-CL Cell culture media
Sterile Water Wisent Bioproducts 809-115-CL DNase, RNase & protease free
Superscript™ III One-Step RT-PCR System  Invitrogen 12574018 RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate
Taq DNA Polymerase  Invitrogen 18038-042 Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride
Transcription Factor Buffer Set BD Biosciences 562725 Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer
Trypan Blue Sigma T8154 Viability dye to count cells using haemacytometer 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chun, T. W., Fauci, A. S. Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).
  2. Finzi, D., et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy. Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).
  3. Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection. Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).
  4. Center for Disease Control and Prevention. A cluster of Kaposi’s sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California. Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).
  5. Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus. Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).
  6. Kunisaki, K. M. Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?. Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).
  7. World Health Organization. . WHO | Tuberculosis and HIV. , (2018).
  8. Jambo, K. C., et al. Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function. Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).
  9. Yeligar, S. M., et al. Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ. AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).
  10. Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages. AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).
  11. Holt, P. G., et al. Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure. Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).
  12. Brenchley, J. M., et al. High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage. Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).
  13. Mwandumba, H. C., et al. Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection. The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).
  14. Gordon, S. B., et al. Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses. Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).
  15. Costiniuk, C. T., et al. HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy. AIDS. 32, 2279-2289 (2018).
  16. American Thoracic Society. . American Thoracic Society – Bronchoalveolar Lavage. , (2004).
  17. King, T. E. . Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage – UpToDate. , (2018).
  18. Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls. European Respiratory Journal. 50, (2017).
  19. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50, 243-248 (1985).
  20. Heron, M., et al. Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung. Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).
  21. Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
  22. Yu, Y. R. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).
  23. Geiser, M. Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).
  24. Costiniuk, C. T., et al. Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study. HIV Medicine. , (2019).
  25. Balfour, L., et al. Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173). AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).
  26. Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir. Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).
  27. Rennard, S. I., et al. Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution. Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).
  28. Twigg, H. L., et al. Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects. The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).
  29. Duan, M., et al. Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease. The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).
  30. Garn, H. Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).
  31. Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  32. Avalos, C. R., et al. Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).

Tags

Bronchoalveolar Lavage (BAL)Alveolar MacrophagesCD4+ T-cellsHIV ReservoirImmunophenotypingPulmonary Mucosal T-cellsVirologic Assessment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Salahuddin, S., Thomson, E., Méziane, O., Farnos, O., Pagliuzza, A., Chomont, N., Olivenstein, R., Costiniuk, C., Jenabian, M. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. J. Vis. Exp. (148), e59427, doi:10.3791/59427 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image