Verarbeitung von Bronchoalveolar Lavage Fluid und Matched Blood für Alveolar Macrophage und CD4+ T-Zell Immunophenotypisierung und HIV Reservoir Assessment
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Verarbeitung von bronchoalveolarer Spülflüssigkeit und abgestimmtem peripherem Blut von chronisch HIV-infizierten Personen auf antiretrovirale Therapie zur Beurteilung von lungenen HIV-Reservoirs. Diese Methoden führen zum Erwerb von hochreinen CD4-T-Zellen und Alveolar-Makrophagen, die anschließend zur Immunphenotypisierung und HIV-DNA/RNA-Quantifizierungen durch ultraempfindliche Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt werden können.
Abstract
Bronchoskopie ist ein medizinisches Verfahren, bei dem normale Saline über ein Bronchoskop in die Lunge injiziert wird und dann abgesaugt wird, wodurch Bronchoalveolar-Lavage (BAL)-Flüssigkeit entfernt wird. Die BAL-Flüssigkeit ist zellreich und kann somit eine “Schnappschuss” des lungenen Immunmilieus liefern. CD4-T-Zellen sind die am besten charakterisierten HIV-Reservoirs, während es starke Hinweise darauf gibt, dass Gewebemakrophagen, einschließlich Alveolarmakrophagen (AMs), auch als virale Reservoirs dienen. Über die Rolle von AMs im Zusammenhang mit der Einrichtung und Wartung von HIV-Reservoirs ist jedoch noch vieles unbekannt. Daher ist die Entwicklung eines Protokolls zur Verarbeitung von BAL-Flüssigkeit zur Gewinnung von Zellen, die in virologischen und immunologischen Assays zur Charakterisierung und Bewertung der Zellpopulationen und Teilmengen innerhalb der Lunge verwendet werden können, für das Verständnis der Rolle der Lunge als HIV relevant. Stauseen. Hierin beschreiben wir ein solches Protokoll, das Standardtechniken wie einfache Zentrifugation und Durchflusszytometrie verwendet. Die CD4-T-Zellen und AMs können dann für nachfolgende Anwendungen verwendet werden, einschließlich Immunphenotypisierung und HIV-DNA- und RNA-Quantifizierung.
Introduction
Eine der größten Herausforderungen für eine Heilung einer HIV-Infektion ist das Vorhandensein des latenten HIV-Reservoirs, das nach der Unterbrechung der antiretroviralen Therapie (ART)1,2eine Erholung der Plasmavirämie verursacht. Während das HIV-Reservoir während der Langzeit-ART in mehreren Gewebeteilen gut dokumentiert ist, einschließlich sekundärer Lymphorgane, Darm-assoziiertem Lymphgewebe (GALT) und des zentralen Nervensystems (ZNS), wurde die Lunge als Untersuchungsgebiet übersehen. seit der Vor-ART-Ära3. Die Lunge spielt jedoch eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von HIV. Tatsächlich gehörten Lungensymptome zu den ersten Indikatoren für AIDS-bedingte opportunistische Infektionen4. Selbst in der modernen ART-Ära haben HIV-Infizierte ein höheres Risiko, sowohl an infektiösen als auch nicht infektiösen Lungenerkrankungen zu erkranken als Menschen ohne HIV. Zum Beispiel sind Menschen mit HIV-Infektion eneinem erhöhten Risiko für invasive Streptokokken-Pneumonie-Infektion, sowie chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD)5,6. Darüber hinaus stellt die Mitinfektion von Tuberkulose (TB) und HIV in bestimmten Regionen der Welt, insbesondere in Afrika südlich der Sahara, eine erhebliche Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar, da HIV-Infizierte 16- bis 27-mal häufiger an Tuberkulose leiden als Hiv-Infizierte7. Obwohl einige Erklärungen für diese Anfälligkeit für Lungeninfektionen und chronische Krankheiten vorgeschlagen wurden8,9,10, die genauen zellulären Mechanismen, durch die Personen mit unterdrücktem HIV Plasmaviruslast weiterhin ein höheres Risiko für lungenmonale Komplikationen sind nicht vollständig aufgeklärt. Wichtig ist, dass HIV ein sehr starker Risikofaktor für Lungeninfektionen und chronische Krankheiten ist, unabhängig vom Raucherstatus6.
Die Analyse der Immunumgebung der Lunge ist daher von entscheidender Bedeutung, um ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Obwohl nichtinvasive, induzierte Sputumproben in der Regel große Mengen an Epithelzellen und Ablagerungen mit seltenen pulmonalen Lymphozyten und ohne AMs enthalten, beschränkt sie ihre Rolle auf bestimmte Anwendungen. Umgekehrt können große Biopsien des Gewebes nicht in Ermangelung einer vermuteten Erkrankung aufgrund des damit verbundenen Risikos von signifikanten Blutungen und Pneumothorax (Kollaps der Lunge) erhalten werden. Darüber hinaus befindet sich die Mehrheit der lungenen Immunzellen hauptsächlich auf der Schleimhautebene, wo die Lunge während der Atmung kontinuierlich durch Antigene stimuliert wird. Zu diesem Zweck hat die Bronchoskopie zur Gewinnung von BAL-Flüssigkeit den Vorteil, dass sie einen relativ sicheren Zugang zu Lymphozyten und AMs bietet (siehe Abbildung 1). Makrophagen stellen den größten Anteil an Zellen innerhalb der BAL-Flüssigkeit dar, gefolgt von Lymphozyten11. Es ist daher sinnvoll, ein Verfahren festzulegen, mit dem BAL-Flüssigkeit für die Verwendung in späteren Anwendungen wie Immunphenotypisierung, Zellkultur, Transkriptomik oder weiteren Anwendungen verarbeitet werden kann. Das hier skizzierte Protokoll zur Verarbeitung der BAL-Flüssigkeit wird an die zuvor beschriebenen allgemeinen Verfahren angepasst und für die verschiedenen eingesetzten Downstream-Assays optimiert. Diese Methode ermöglicht die Isolierung sowohl pulmonaler Lymphoid- als auch myeloischer Schleimhautimmunzellen für ihre phänotypische und funktionelle Charakterisierung sowie eine Bewertung des HIV-Reservoirs bei Erwachsenen, die mit HIV leben.
Um dieses Protokoll zu erstellen, haben wir die folgenden Kriterien verwendet, um Studienteilnehmer zu rekrutieren15. Damit die Teilnehmer an dieser Studie teilnehmen können, mussten sie HIV-infizierte Personen sein, die mindestens drei Jahre lang die folgenden Kriterien erfüllten: (1) auf ART; (2) unterdrückte Viruslast (VL) für mindestens 3 Jahre; (3) CD4 T-Zellzahl von 200/mm3; (4) bereit, sich der Forschungsspirometrie und Bronchoskopie zu unterziehen. Patienten mit folgenden Kriterien wurden von der Studie ausgeschlossen: (1) Kontraindikation(en) zur Bronchoskopie; (2) hohes Blutungsrisiko: Koagulopathie oder Warfarin- oder Clopidogrel-Therapie; (3) Thrombozytopenie (niedrige Thrombozyten); (4) aktive Lungeninfektion oder ein anderer akuter pulmonischer Prozess; (5) Schwanger werden/versuchen, schwanger zu werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschrieben wir ein Verfahren zur Verarbeitung von BAL-Flüssigkeit zur Gewinnung von CD4-T-Zellen und AMs, zusammen mit übereinstimmenden PBMCs, die untersucht werden können, um das HIV-Reservoir in der Lunge zu untersuchen. Wir berichteten vor kurzem über DIE HIV-DNA-Quantifizierung in CD4-T-Zellen aus übereinstimmenden peripheren Blut- und BAL-Proben, und unsere Gruppe zeigte, dass HIV in Lungen-CD4-T-Zellen 13-mal häufiger vorkommt als in denen aus peripherem Blut15. Allerdings sind die HIV-DNA-Werte in AMs von Spendern abhängig, so dass es bisher keine konsistente Korrelation zwischen den HIV-DNA-Spiegeln in den Lymphozyten im Vergleich zu Makrophagen15gegeben hat. Der Zugang zu diesen primären Makrophagenzell-Untergruppen wird jedoch ein wichtiges Werkzeug sein, um diese Frage zu hinterfragen und ein besseres Verständnis der Viruslast in der Lunge im Zusammenhang mit dem HIV-Reservoir zu erlangen.
In der Vor-ART-Ära und in mehreren anderen Studien unter Verwendung von BAL-Flüssigkeit wurden die Teilnehmer einer Bronchoskopie unterzogen, um eine vermutete Pathologie zu diagnostizieren oder eine mikrobiologische Diagnose für Atemwegssymptome zu erhalten3. Wir konnten jedoch Teilnehmer ohne aktive Lungensymptome oder Pathologien rekrutieren und alle Teilnehmer unterzeichneten ein ethisches Einverständnisformular15. Wir konnten Teilnehmer aus unserem Zentrum rekrutieren, die an anderen Studien wie einer Spirometrie-Screening-Studie für obstruktive Lungenerkrankungen24teilnahmen, sowie solche, die sich anderen Forschungsverfahren wie Leukapherese und Koloskopie. Frühere Untersuchungen unter HIV-Infizierten zeigten, dass Altruismus ein Schlüsselfaktor ist, der die Teilnahme an Forschungsstudien motiviert25. Wie bei vielen menschlichen Exemplaren haben wir eine große Variabilität von Mensch zu Mensch festgestellt. Es gab keine Möglichkeit, “vorherzusagen”, von welchen Teilnehmern wir BAL mit guten oder schlechten Zellerträgen erhalten würden. Im Gegensatz zu peripherem Blut, das eine ziemlich konsistente Anzahl von Lymphozyten ergibt, sind die Zellzahlen in BAL-Flüssigkeit sehr variabel. Die Injektion eines größeren Volumens an normaler Saline in die Lunge (mit der Hoffnung auf eine größere Rückkehr von BAL-Flüssigkeit) ist nicht immer möglich, da größere Mengen an normaler Saline oft mit mehr Husten und einem höheren Risiko für eine Fieber-Postbronchoskopie verbunden sind. Wir bemerkten, dass die Verwendung eines kleineren (anstatt größeren) Durchmessers Bronchoskop ermöglichte es dem Respirologen, tiefer in die Bronchien zu gelangen und Flüssigkeit zu erhalten, die größere Mengen an Zellen enthält. Eine konsequente Feststellung war, dass Tabakraucher viel größere Anteile an AMs hatten als Lymphozyten in ihrer BAL-Flüssigkeit, was erwartet wird, da AMs Schutt und Feinstaub verschlingen. Darüber hinaus beobachteten wir, dass BAL-Flüssigkeit von Rauchern Ablagerungen enthielt, die die verwendeten Geräte blockieren können, wie PCR-Maschinen und Durchflusszytometer. Ähnliche Probleme können in Gebieten mit hoher Verschmutzung oder Personen beobachtet werden, die häufiger einer schlechten Luftqualität ausgesetzt sind.
Im Hinblick auf ihre Rolle bei der Etablierung von HIV-Reservoirs und viraler Persistenz ist die Reinheit von CD4-T-Zellen und AMs eine zentrale Überlegung. Aus diesem Grund haben wir uns für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) entschieden, um hochreine Zellpopulationen zu erhalten. Es ist auch möglich, dass die gesammelte BAL-Flüssigkeit mit Blut kontaminiert sein kann, da einige kleinere Blutungen während einer Bronchoskopie erwartet werden; das Vorhandensein naiver B-Zellen würde dies anzeigen, und Zellen können in einem Lysepuffer für rote Blutkörperchen gewaschen werden, um dieses Problem zu umgehen. Eine weitere Herausforderung bei der Untersuchung von BAL-Flüssigkeit betrifft die Quantifizierung von Entzündungsmarkern und Zytokinen, die für das Verständnis der HIV-Persistenz wichtig sind26. Da die instillierte Saline die BAL-Flüssigkeit verdünnt, kann der Gehalt an Entzündungsmediatoren und Zytokinen schwierig zu messen sein. Obwohl ein Harnstoffkorrekturfaktor vorgeschlagen wurde, um die Verdünnung zu berücksichtigen, gibt es relativ wenig Literatur, die seine Verwendung beschreibt27,28.
AMs sind stark autofluoreszierend, was ein Problem bei der Zellsortierung und Flusszytometrie phäkotypische Analyse darstellt. Insbesondere ist der Effekt bei Rauchern, deren AMs vollständig schwarz sein können, ausgeprägter, was ihre Autofluoreszenz erheblich beeinflusst. Wenn die AM-Autofluoreszenz von einem standardmäßigen blauen 488 nm Laser angeregt wird, erreicht sie ihren Höhepunkt bei etwa 540 nm, der sich mit den Fluoreszenzspektren von häufig verwendeten Konjugaten wie FITC und PE29,30überschneidet. Es ist erwähnenswert, dass zwei separate Laser verwendet werden können, um FITC und PE zu begeistern (z. B. PE durch das Gelb/Grün und FITC durch den blauen 488 Laser). Um die inhärente Autofluoreszenz mit FITC zu überwinden, verwendeten wir ungefärbte AMs, um den Hintergrund der Autofluoreszenz zu bestimmen. Darüber hinaus kann die Verwendung von Fluoreszenz-Kontrollen abzüglich 1 (FMO) sehr nützlich sein, um diese technischen Probleme zu bekämpfen. Es können größere Perlen (z.B. 7,5 m) verwendet werden, die näher an der Größe zum Ausgleich von Makrophagenpopulationen sind, im Vergleich zu kleineren Perlen (z. B. 3,0 m), die zur Kompensation von Lymphozytenpopulationen verwendet werden können. Ein noch geeigneterer Ansatz wäre es, einen kleinen Zellanteil als Einzelflecksteuerung zu verwenden, wobei ein bekannter, hochgradig exprimierter Marker auf der Teilmenge, wie HLA-DR oder CD45, zu jedem der gewünschten Fluorchrome konjugiert würde, was eine viel mehr eine genaue Kompensation, die mit Perlen erreicht werden kann. Bei Raucherproben ist diese Taktik besonders nützlich, da die Makrophagen viel größer und autofluoreszierender sind. Darüber hinaus konnte ab dem Vorbereitungsschritt die gesamte BAL-Probe vor der Sortierung wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben in einer Platte kultiviert werden, um eine Trennung der Populationen durch Einhaltung zu ermöglichen. Auf diese Weise können die anhaftenden Makrophagen von anderen nicht haftenden Zellen wie Lymphozyten isoliert werden. Die Kompensation ist weit weniger anspruchsvoll, wenn die Lymphozyten- und AM-Populationen getrennt werden, anstatt sie gemeinsam zu untersuchen; Wenn Sie sich jedoch auf die Einhaltung verlassen, wird dies zu einem Verlust von Makrophagen führen, was eine wichtige Überlegung ist, wenn die Zellzahlen bereits begrenzt sind. Außerdem kann ein Adhärenzschritt zur unerwünschten Aktivierung von anhaftenden Monozyten führen, was sich auf die mit diesen Zellen erzeugten nachgelagerten Ergebnisse auswirken kann. Der Wert der effizienten Sortierung von Zellen in reinere Populationen muss gegen die Beschränkung abgewogen werden, weniger solche Zellen für nachfolgende Experimente zu haben.
Andere Modelle, vor allem murine Modelle, wurden verwendet, um makrophagenimmunologische Eigenschaften und Biologie zu studieren. Diese Modelle sind zwar äußerst nützlich und ermöglichen einen großartigen Einblick in einen schwer zu manipulierenden Zelltyp, aber sie haben Einschränkungen. Viele der Zelloberflächenmarker variieren zwischen Mäusen und Menschen, so dass der Immunophenotyp menschlicher AMs nicht vollständig verstanden wird. Dieses Modellsystem erfordert jedoch die Bündelung mehrerer Mäuse für Assays aufgrund der geringen Zellzahlen, die von jedem Tier zur Verfügung stehen. Darüber hinaus schließt die Notwendigkeit, Proben zu bündeln, Überlegungen zur genetischen Veranlagung und zum Geschlecht aus. Kürzlich hat sich gezeigt, dass Sex eine Rolle bei der Infektiosität von Makrophagen durch HIV-1 spielt, aufgrund der unterschiedlichen Expression des Restriktionsfaktors SAMHD-131. Nichtmenschliche Primaten (NHP) stellen das dem Menschen am nächsten ste Teer modellte und erleichterten die Untersuchung der Simian-Immundefizienzvirus-Infektion (SIV) und ihrer Wirkung auf das Immunsystem, was einen Einblick in die Rolle von geweberesidenten Makrophagen im Vergleich zu monozytenabgeleiteten Makrophagen. In Rhesusmakaken wurde auch gezeigt, dass Lungenmakrophagenisolate von BAL ein replikationsfähiges Virus beherbergen; ein viraler Auswuchs-Assay (VOA) wurde verwendet, um das Verhalten von SIV in geweberesidenten Zellen zu analysieren32. Ein solcher Befund ist von erheblichem Forschungswert, muss aber noch beim Menschen validiert werden, bevor er angewendet werden kann, und die hohen Kosten für die Verwendung von NHPs schließen die Verwendung großer Stichprobenpopulationen aus. Darüber hinaus werden menschliche AMs für viele andere Anwendungen wie In-vitro-Virus/Mikroben-Infektionstests und für Studien mit anderen Krankheitserregern wie Tuberkulose/HIV-Koinfektion nützlich sein.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten ihre Geldgeber würdigen: die Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant #153082 an CC, MAJ, NC); die Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S), die CC und MAJ und der Medizinischen Fakultät der McGill University, die CC gefördert haben, Mittel gewährten. Diese Studie wurde auch teilweise von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt- finanziert Canadian HIV Cure Enterprise (CanCURE) Team Grant HB2 – 164064 to MAJ, CC und NC. MAJ hält den CIHR Canada Research Chair Tier 2 in Immunovirology und CC und NC einen FRQ-S Junior 1 bzw. Junior 2 Research Salary Award. ET ist MIT dem RI-MUHC Studentship MSc Award ausgezeichnet.
Darüber hinaus möchten die Autoren Josée Girouard und alle klinischen Mitarbeiter, die an der Koordinierung und Beschaffung der Proben beteiligt sind, sowie die Atemtherapeuten würdigen; Ekaterina Iourtchenko, Héléne Pagé-Veillette und Marie-Héléne Lacombe auf der RI- MUHC Immunophenotyping Plattform; und Dr. Marianna Orlova für die Bereitstellung der Mikroskopiefotos. Vor allem aber möchten sich die Autoren bei den vielen ehrenamtlichen Helfern bedanken, ohne die diese Forschung nicht möglich wäre.
Materials
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
| ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
| BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
| BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
| Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
| Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
| CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
| CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
| CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
| CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
| CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
| dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
| EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
| FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
| FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
| FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
| HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
| HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
| Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1°C/minute, the optimal rate for cell preservation |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
| PBS 1X | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
| PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
| PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
| QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
| Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
| RPMI 1640 1X | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
| Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
| Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride |
| Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |
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