Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa
Summary
Este protocolo introduz um procedimento de funcionamento padrão do laboratório para o teste diagnóstico de antígenos do lyssavirus nos bastões em Formosa.
Abstract
Vírus dentro do gênero lyssavirus são patógenos zoonóticos, e pelo menos sete espécies de lyssavirus estão associadas a casos humanos. Porque os morcegos são reservatórios naturais da maioria dos lissavírus, um programa de vigilância de lyssavirus de morcegos tem sido conduzido em Taiwan desde 2008 para entender a ecologia desses vírus em morcegos. Neste programa, organizações não-governamentais de conservação de morcegos e centros de controle de doenças animais locais cooperaram para coletar morcegos mortos ou morcegos morrendo de fraqueza ou doença. Os tecidos cerebrais dos morcegos foram obtidos por necropsia e submetidos ao teste de anticorpo fluorescente direto (FAT) e reação em cadeia da polimerase reversa (RT-PCR) para detecção de antígenos de lyssavirus e ácidos nucleicos. Para a FAT, recomenda-se pelo menos dois conjugados de diagnóstico de raiva diferentes. Para o RT-PCR, dois conjuntos de primers (JW12/N165-146, N113F/N304R) são usados para amplificar uma sequência parcial do gene da nucleoproteína do lyssavirus. Este programa de vigilância monitora os lissavírus e outros agentes zoonóticos em morcegos. O lyssavirus do bastão de Formosa é encontrado em dois casos do pipistrelle japonês (ABRAMUS de Pipistrellus) em 2016 – 2017. Esses achados devem informar o público, os profissionais de saúde e os cientistas sobre os potenciais riscos de contato com morcegos e outros animais selvagens.
Introduction
Vírus dentro do gênero lyssavirus são patógenos zoonóticos. Há pelo menos sete espécies de lyssavirus associadas a casos humanos1. Além das 16 espécies deste gênero1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (twblv)4 e Kotalahti bat lyssavirus5 foram recentemente identificados em morcegos, mas seus status taxonômicos ainda não ser determinado.
Os morcegos são os hospedeiros naturais da maioria dos lissavírus, com exceção de Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, que ainda não foram identificados em nenhum morcego1,2,3,6. A informação sobre os lyssavirus em morcegos asiáticos ainda é limitada. Dois lyssavirus não caracterizados em morcegos asiáticos (um na Índia e outro na Tailândia)7,8foram relatados . Um caso humano da raiva associou com uma mordida de bastão em China foi relatado em 2002, mas o diagnóstico foi feito somente pela observação clínica9. Em Ásia Central, o lyssavirus de Aravan foi identificado no morcego rato-eared menor (Myotis blythi) em quirguistão em 1991, e o lyssavirus de Khujand foi identificado no morcego whiskered (Myotis mystacinus) em tajikistan em 200110. Em Ásia Sul, o lyssavirus do bastão de Gomes foi identificado na raposa Indian do vôo (medius de Pteropus) em Sri Lanka em 20153. No sudeste asiático, vários estudos sorológicos sobre morcegos nas Filipinas, Tailândia, Bangladesh, Camboja e Vietnã mostraram soroprevalência variável11,12,13,14, quinze anos. Embora o lyssavirus de Irkut fosse identificado no bastão tubo-cheirado maior (leucogaster de Murina) na província de Jilin, China em 201216, as espécies exatas e as posições de lyssavirus em populações asiáticas orientais do bastão permanecem desconhecidas.
Para avaliar a presença de lyssavirus em populações de morcegos taiwaneses, iniciou-se um programa de vigilância empregando tanto a FAT direta como a RT-PCR. O lyssavirus do bastão de Formosa foi identificado em dois casos do pipistrelle japonês (ABRAMUS de Pipistrellus)4 em 2016 – 2017. No artigo atual, um procedimento de funcionamento padrão do laboratório é introduzido para a fiscalização do Lyssavirus da população do bastão em Formosa. O fluxograma do diagnóstico do lyssavirus do bastão em nosso laboratório é apresentado em Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimento de funcionamento padrão do laboratório (SOP) fornece um processo de série para testar amostras do bastão para a presença de antígenos do lyssavirus em Formosa. Os passos principais incluem o emprego de FAT e RT-PCR. A seleção de amostras apropriadas e o isolamento bem-sucedido do vírus também são importantes. Adicionalmente, alguma solução de problemas foi conduzida durante a monitoração de lyssavirus do bastão. A diferença principal era os animais do alvo. Inicialmente (2008 – 2009),…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-jung Tsai e Ya-LAN li por sua assistência durante este estudo. Este estudo foi apoiado por Grant no. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) do Bureau de inspeção e quarentena de saúde animal e vegetal, Conselho de agricultura, executivo Yuan, Taiwan.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trppsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trppsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
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