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医学

Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano

Published: December 16, 2019
doi:
10.3791/59419
, , , ,
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, New Jersey Medical School,Rutgers Biomedical and Health Sciences, 2Rutgers School of Graduate Studies at New Jersey Medical School,Rutgers Biomedical and Health Sciences, 3Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, New Jersey Medical School,Rutgers Biomedical and Health Sciences

Summary

Este protocolo fornece um método livre de enzimas para isolar as células-tronco mesenquímicas de abdominoplastia e amostras lipoaspirate usando um método explant. A ausência de enzimas duras ou etapas de centrífuga fornece células-tronco clinicamente relevantes que podem ser usadas para estudos in vitro ou transferidas de volta para a clínica.

Abstract

As células-tronco mesensínmicas (MSCs) são uma população de células multipotentes que podem ser isoladas de vários tecidos adultos e fetais, incluindo tecido adiposo. Como um tipo de célula clinicamente relevante, métodos ideais são necessários para isolar e expandir essas células in vitro. A maioria dos métodos para isolar os MSCs derivados do adiposo (ADSCs) dependem de enzimas duras, como a colagem, para digerir o tecido adiposo. No entanto, embora eficazes na quebra do tecido adiposo e na produção de uma alta recuperação adsc, essas enzimas são caras e podem ter efeito prejudicial sobre os ADSCs – incluindo os riscos do uso de componentes xenogênicos em aplicações clínicas. Este protocolo detalha um método para isolar ADSCs de amostras frescas de lipoaspirate e abdominoplastia sem enzimas. Momentaneamente, este método confia na dissociação mecânica de todo o tecido maioria seguido por um sistema de cultura do explant-tipo. Os ADSCs estão autorizados a migrar para fora do tecido e para a placa de cultura do tecido, após o que os ADSCs podem ser cultivados e expandidos in vitro para qualquer número de pesquisas e /ou aplicações clínicas.

Introduction

As células-tronco mesenchymal (MSCs) são uma classe de células-tronco adultas multipotentes que podem ser isoladas de vários tecidos adultos e fetais, incluindo de tecido adiposo. Estas células são um tipo de célula atraente para pesquisa básica e aplicações clínicas devido à sua plasticidade para diferenciar em células de todas as camadas germinativas in vitro, atravessar barreiras alogênicas, lar de áreas de inflamação, e suprimir a inflamação (revista em Sherman, et al.1). Os MSCs derivados do adiposo (ASCs) são particularmente atraentes devido à sua facilidade de obtenção, uma vez que o tecido adiposo é geralmente considerado tecido de descarte após procedimentos de lipoaspiração e abdomlastia de rotina. No entanto, uma vez obtidas, as amostras são geralmente submetidas a condições adversas – condição enzimática ou centrifugação – a fim de isolar os ASCs2,3. Este método ilustra um procedimento simples para isolar ASCs usando um método explant, na ausência de duras etapas enzimáticas ou centrífugas.

O método mais comum de isolar ASCs consiste em lavar uma amostra adiposa, digerir enzimaticamente a amostra com colagem, centrífuga da amostra e, finalmente, liromper os glóbulos vermelhos antes de cultivar os ASCs4. Embora eficiente em isolar um alto rendimento de ASCs, o uso de componentes xenogênicos (por exemplo, digestão enzimática com colagem) é considerado mais do que “minimamente manipulado” pela Food and Drug Administration E.U., e pode representar riscos como a reação imune, proibindo o uso das células na clínica5,6. Para minimizar os riscos de componentes xenogênicos, muitos grupos sugeriram enzimas fabricadas e derivadas não-animais para digerir o tecido adiposo. No entanto, estas enzimas ainda são duras, e pode alterar o fenótipo decélulas 7.

Outros métodos de isolar ASCs incluem centrífuga de alta velocidade, usando forças tão altas quanto 1.200 x g,e vórtice para isolar os ASCs8. Mesmo forças tão baixas quanto 400 x g foram suficientes para isolar ASCs viáveis9. Enquanto essas células produzem uma grande quantidade de células viáveis, muitos protocolos não proliferaram além de 14 dias8. Além disso, o isolamento mecânico produz menos células recuperadas do que a digestão enzimática, mas uma proporção maior de células isoladas eram ASCs em comparação com outras células endógenas ao tecido adiposo na passagem 010.

O isolamento de uma população mais pura e viável de ASCs em menos tempo, juntamente com o custo e os riscos dos componentes xenogênicos, torna a digestão enzimática cada vez menos atraente para a tradução para a clínica. Embora o isolamento mecânico seja inicialmente uma abordagem favorável, há uma disparidade significativa nos métodos utilizados, e o volume de tecido processado é limitado ao tamanho das unidades centrífugas especializadas e pode depender da consistência do operador2.

Enquanto tanto a digestão enzimática quanto a centrífuga rapidamente produzem um alto volume de ASCs, essas células isoladas mostram mudanças pofonípicas, produzindo perguntas sobre seu comportamento quando devolvidas a um paciente2. Um método explanta-baseado da isolação de ASC, como descrito neste protocolo, está sendo empregado assim por alguns grupos,por meio de que os ASCs migram fora das partes pequenas de tecido adiposo contínuo3,11,12. Esta migração é provavelmente um efeito das células que estão sendo atraídas para a mídia rica em nutrientes. Como outras populações de MSCs, ASCs aderir ao plástico, e sobreviver e proliferar na mídia cultura de tecido usado (componentes abaixo), permitindo o seu isolamento dos outros tipos de células do tecido adiposo. Enquanto menos células são inicialmente recuperadas – muitas vezes tendo > 1 semana até que as células são visíveis na placa de cultura do tecido – estes ASCs não manipulados proliferarão in vitro, permitindo a expansão das células para volumes clinicamente relevantes11,12,13.

Protocol

O uso de amostras de lipoaspirate e abdominoplastia foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) da Universidade Rutgers – Newark Campus. 1. Preparação da Mídia cultura de tecidos Prepare estéril500 mL de meios da cultura do tecido antes de isolar ASCs. Para preparar a mídia cultural, adicione 10% definido soro de vitela fetal (FCS) e Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/100 mL) à mídia essencial mínima de Dulbecco (DMEM) com alta glicose e 2 mM L-glutamina. Os meios de comunicação podem ser armazenados a 4 °C por até 3 semanas e devem ser sempre usados quentes (entre a temperatura ambiente e 37 °C). Se um meio de comunicação diferente é preferido para a cultura das células-tronco, prepare essa mídia em seu lugar. 2. Isolamento de ASCs de tecido adiposo Obter lipoaspiratas ou amostra de abdominoplastia (s). Após a aprovação do IRB, obter amostras como descartar tecido após vários procedimentos cirúrgicos. Transporte os lipoaspirates para o laboratório em qualquer embarcação o cirurgião removeu o tecido; transportar amostras de abdominoplastia em um saco de espécimes de sala de cirurgia ou recipiente. Guarde a amostra (s) à temperatura ambiente por até 6 h ou a 4 °C por até 24 h se não estiver processando imediatamente. Amostras de tecido processadas além dos tempos acima mencionados provavelmente terão um rendimento celular diminuído. Mantenha amostras de abdominoplastia úmidas pela adição de soro soro para os soro para os soro de somindolo tampão de fosfato estéril. A partir deste ponto, conduza todos os passos em um capô de fluxo laminar condições assépticas. Use luvas para proteção pessoal. Mantenha 10% de lixívia, 70% de etanol e toalhas de papel nas proximidades para limpar rapidamente quaisquer derramamentos biológicos. Alienado de qualquer excesso de tecido como resíduos biomédicos. Pique as amostras em pedaços de 1 mm. Se o bloco de abdominoplastia é muito grande para trabalhar, corte um tamanho gerenciável de tecido fora do bloco antes de picar. Transfira o tecido da abdominoplastia para a tampa de uma placa estéril de 100 mm. Use uma agulha estéril para segurar um pedaço de tecido no lugar e usar um bisturi estéril para picar os pedaços fora por corte ou suavemente desfiação fora do tecido a granel. Este passo geralmente não é necessário para lipoaspirates. No entanto, se grandes pedaços de tecido são observados no lipoaspirate, retire tais pedaços com fórceps estéreis e processe como acima. Transfira o tecido para um tubo fresco e inverter ou agitar a amostra 5-6 vezes para garantir a mistura de todas as camadas. Opcional: se o lipoaspirate tiver se estabelecido totalmente, retire e descarte a camada de óleo antes da mistura. Transfira 2,5-5 mL de tecido para um plasma de gás a vácuo de 100 mm tratado placa de cultura do tecido(Tabela de Materiais). Medir o volume da amostra derramando em um tubo de centrífuga fresco. Se necessário, use uma espátula estéril para ajudar na transferência do tecido. Adicione um volume equivalente de meios da cultura do tecido à placa. Delicadamente redemoinho a placa para misturar o conteúdo. Incubar os patês a 37 °C em 5% DE CO2 até que um número suficiente de células seja visto na base da placa. Ao longo do tempo, as células migrarão de dentro do tecido para a superfície da placa, altura em que irão aderir ao plástico. Como eles saem do tecido, as células aparecerão como pequenos aglomerados em torno dos pedaços de tecido. A cada 24 h, remover o máximo de fluido possível e substituir por uma quantidade semelhante de mídia. Deixe os pedaços de tecido no lugar, se possível. Uma vez que um número suficiente de células são anotados na placa (>10 clusters de > 15-25 células na placa) ou após 7 dias, o que for mais cedo, remover todos os pedaços restantes de tecido. Cultura os ASCs na mídia cultura de tecidos até que eles atinjam 70% de confluência ou até que os aglomerados se tornem densos (>5 aglomerados densos de células na placa, cada um com um diâmetro de aproximadamente > 500 μm), momento em que as células devem ser passagens. 3 Cultura de ASCs Passagem dos ASCs quando a placa de pai atinge aproximadamente 70% de confluência. Tome cuidado para evitar mais de confluência das culturas ASC. Lave suavemente a placa com soro sinológico tampão de fosfato 1x e tripicinizar as células aderentes. Para trypsinizar as células, aspirar o soro salino tampão de fosfato e adicionar 1 mL de trypsin com 0,25% EDTA para cada placa e incubar a 37 °C para 5 min. Após 5 min, confirme a desadesão por microscopia. Se as células ainda são aderentes, devolva as células para a incubadora por mais 5 min. Adicione uma pequena quantidade de mídia (aproximadamente 25% do volume total de tripsina) à placa para desativar a trippsina e lavar suavemente a base da placa usando a mídia/trippsina. Para lavar a placa, segure a placa em um ângulo leve e delicadamente pipeta a mídia / trippsin a partir do topo da placa para baixo, soltando todas as células anexadas semanais da placa. As células podem ser rebanhadas em uma proporção de 1:3 ou semeadas a uma densidade de 120.000-500.000 células por placa. Se a semeadura baseada na contagem celular, transfira a trippsina/mídia da placa para um tubo cônico de centrífuga e pelota as células por centrífuga a 300 x g por 7 minutos. Resuspende as células na mídia da cultura do tecido (aproximadamente 1 mL por placa inicial) e conte as células antes da semeadura. Para contar as células, transfira 10 μL da suspensão celular para o hemocytometer e conte as células presentes no quadrante 4 x 4 em cada canto da grade. Média desses valores juntos e multiplicar o valor por 104 para calcular o número da célula. Adicione mídia à placa antes de semeadura das células. Adicione as células de uma forma distente e, em seguida, redemoinho da placa para garantir até mesmo a distribuição em toda a placa.NOTA: Depois de 3 passagens, as células aderentes devem aparecer assimétricas e em forma de fuso. O fenótipo e o comportamento de ASC podem ser confirmados usando ensaios da citometria e da diferenciação do fluxo. Confirmação do fenótipo e comportamento asc usando citometria de fluxo e ensaios de diferenciação Citometria de fluxo Coletar e pelotas as células, como descrito acima. Lave o pelleted com soro soro lógico 1x e rotular as células com o fabricante recomendado volumes de anticorpos. Um protocolo detalhado para citometria de fluxo, um procedimento de laboratório comum, pode ser encontrado aqui12,14,15. Selecione painéis de marcadores de superfície do seguinte para confirmar o fenótipo ASC: negativo para CD14, CD31, CD34, CD45 e CD106; e positivo para CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, e CD10516,17,18,19. A presença de CD36 e a ausência de CD106 discernem ASCs dos MSCs20derivados da medula óssea. Differentiation Assays: Confirme a diferenciação multilineage usando um kit de diferenciação MSC. Kits estão disponíveis de vários fabricantes para confirmar a capacidade de diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica. Alterar a mídia fornecida pelo kit a cada 3-4 dias de acordo com os protocolos do fabricante por 3 semanas ou até que a diferenciação morfológica seja observada. Cultura as células para várias passagens; o número de passagens necessárias dependerá da aplicação (s). Em cada passagem, confirme a morfologia e fenótipo de células MSC usando os marcadores de superfície celular acima mencionados e garanta que a capacidade de diferenciação de multilinhaidade não tenha sido perdida. Embora o potencial de expansão difere entre os doadores, a maioria das amostras pode ser expandida para até 6-9 passagens. Criopreserve as células e armazenar em nitrogênio líquido para uso futuro. 4 Criopreservação de ASCs Prepare 10 mL de soluções de congelamento A e B. Para a solução de congelamento A, adicione 20% FCS ao DMEM com glicose alta. Para a solução de congelamento B, adicione 20% FCS e 20% de sulfeto de dimetil (DMSO) ao DMEM com alta glicose. Pelotas as células por centrífuga em 300 x g para 5 min. Resuspender as células em um pequeno volume de congelamento solução A e contar as células usando um hemocytometer como no passo 3.3.1. Calcule o volume final em que as células serão resuspensas para alcançar uma concentração final de células de 500.000 a 1.000.000 células/mL. Use a solução de congelamento A para resuspender a pelota em 50% desse volume final. Lentamente adicione um volume igual de solução de congelamento B dropwise ao agitar o tubo para alcançar a concentração final da célula. Congele imediatamente as células em crioviais de 1-2 mL. Congele os crioviais em um congelador de taxa controlada ou em um recipiente de congelamento colocado em -80 °C, o que diminui a temperatura em 1 °C/min. Após o congelamento controlado (durante a noite para um recipiente de congelamento), transfira as células para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

Representative Results

Usando o método detalhado aqui, ASCs foram isolados com sucesso das amostras do lipoaspirate e do abdominoplastia (figura 1). Após três passagens, as células isoladas foram encontradas para ter uma morfologia MSC (assimétrico, forma de eixo) e fenótipo, semelhante aos ASCs após a digestão enzimática (Figura 2). Estudos anteriores do nosso grupo e outros têm mostrado esses ASCs para diferenciar em adipócitos, osteócitos e neurônios como outros MSCs, incluindo ASCs isolados por outros meios11,21. Na maioria dos casos, a migração ascs para a placa de cultura do tecido pode ser visualizada dentro de 3-5 dias por microscopia de campo brilhante. No entanto, em alguns casos, apenas as células esparsas serão visíveis após 7 dias. Em casos raros, as células não migrarão para a placa e/ou não proliferarão até a terceira passagem. Este resultado geralmente se correlaciona com um atraso no processamento da amostra de tecido. Figura 1: Representação esquemática do isolamento asc de abdominoplastia e amostras lipoaspirate. Abdominoplastia e amostras lipoaspirate foram obtidas como tecido de descarte após procedimentos cirúrgicos de rotina. Amostras de abdominoplastia foram desfiadas, após as quais amostras abdominoplastia ou lipoaspirate foram banhadas como explants na mídia de cultura de tecidos. Os ASCs migraram para fora do tecido, para a mídia rica em nutrientes. Após 1 semana, as explantas foram removidas e as ASCs cultivadas para experimentação a jusante e/ou aplicação clínica. Clique aqui para ver uma versão maior deste número. Figura 2: ASCs isolados com morfologia e fenótipo msc. ASCs isolados pelo método de explante sem enzimas têm uma morfologia e fenótipo MSC na passagem 3. (A) Como outros MSCs, estes ASCs têm uma forma assimétrica, fuso, seja isolada pelo método explant ou enzimático (por exemplo, colagem). Os ASCs isolados usando o método enzimático produzem uma morfologia mais longa e mais estreita em comparação com os ASCs isolados explant; Este último mais próximo assemelha-se aos MSCs derivados de outros métodos de isolamento sem enzimas, como os MSCs derivados da medula óssea. (B) Como outros MSCs, os ASCs isolados explante são negativos para CD45 e positivos para CD73, CD90 e CD105. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussion

Ascs são uma fonte atraente de MSCs devido ao fácil acesso do tecido. Para aplicações clínicas e de pesquisa, os cientistas devem ter em mente a variabilidade dos doadores ao isolar e cultivar essas células. Por razões ainda a serem elucidadas, os MSCs de diferentes doadores mostram diferentes capacidades para proliferar in vitro, o que afetará posteriormente a migração do ASC para fora da capacidade de explanta e proliferação adiposa. Embora a variabilidade possa ser observada no tempo que leva para que os ASCs isolados dessas explantas livres de enzimas atinjam a confluência, era raro uma amostra não proliferar in vitro.

Além da variabilidade dos doadores, a fonte mais provável de falha das células para migrar para fora do tecido e/ou proliferar in vitro é o período de tempo em que o tecido foi armazenado antes do processamento. Quando as amostras foram permitidas sentar-se para >12 h antes do processamento ou não foram mantidas húmidas entre a colheita e o processamento, umas taxas mais pobres da migração e da proliferação foram observadas. As únicas amostras que freqüentemente não proliferavam foram amostras de abdominoplastia que não foram mantidas úmidas com uma solução soroparana: nesses casos, o tecido no centro do bloco de tecido era muitas vezes úmido o suficiente para processar, mas ocasionalmente precisava ser descartado. É assim crítico manter o tecido húmido da época da colheita com o processamento.

Nos casos em que as ASCs não são observadas na placa na marca de 1 semana, os explants adiposos ainda devem ser removidos das placas da cultura do tecido para que não ocorra necrose do tecido. Às vezes, há muito poucas células para identificar facilmente, mas essas poucas células serão capazes de se expandir dentro do sistema de cultura. Se as células ainda não forem observadas às 3 semanas, o isolamento deve ser considerado falhado.

Em alguns casos, particularmente da abdominoplastia, não é possível obter uma amostra verdadeiramente asséptica devido às limitações dentro da arena cirúrgica. Se não for possível usar uma embarcação estéril para transportar o tecido da sala de cirurgia para um capô de fluxo laminar, a remoção de 1 cm externo do tecido é geralmente suficiente para evitar a contaminação por microrganismos. Se a amostra de abdominoplastia estiver ligada à pele, a pele pode ser apagada com 70% de etanol para esterilizar essa superfície antes de picar o tecido adiposo.

Durante o processo de picar, é fundamental que o tecido é picado em pedaços pequenos e finos. Se as explantas forem muito grandes, não haverá área de superfície suficiente para que os ASCs migrem para fora do tecido e para a placa. Além disso, é fundamental que o tecido não permaneça na placa por mais tempo do que o necessário para que o tecido não se torne necrótico.

Uma limitação deste método é o uso de uma enzima (no protocolo descrito, trippsina) para separar os ASCs durante o processo de cultura do tecido. Outras enzimas derivadas não-animais, como accutase, podem ser substituídas para remover a necessidade de produtos derivados de animais, no entanto, isso aumentará o custo da cultura do tecido. Por esta razão, entre outros, numerosos grupos estão investigando métodos de cultura de tecidos não bidimensionais, como biorreatores e sistemas à base de andaimes para aumentar o potencial de crescimento do MSC, minimizando a necessidade de separar as células de seu substrato22.

Ao mover ASCs para a clínica, uma grande limitação do método de isolamento explant é a dependência de uma boa prática de fabricação (GMP) instalações de cultura de tecido nível, que muitos centros médicos não têm. Nestes casos, qualquer um dos métodos independentes disponíveis comercialmente baseados em enzimas ou centrífugas precisaria ser empregado. No entanto, à medida que as instalações de MPG se tornam mais prevalentes, espera-se que este efeito seja limitado. Enquanto isso, mesmo essas instalações sem instalações de cultura de tecido GMP podem considerar o uso do método explant para estudar ASCs in vitro: quanto menos manipulação, mais semelhantes essas células são para suas contrapartes in vivo11.

Este método fornece uma maneira simples de isolar ASCs do tecido adiposo – lipoaspirates e abdominoplasties – na ausência de enzimas ásperas ou passos de centrífuga. Embora o rendimento inicial dos ASCs seja menor do que o de outros métodos, os ASCs proliferarão in vitro, minimizando o efeito do menor rendimento inicial. A falta de manipulação excessiva ou enérgica torna os ASCs isolados de tal forma particularmente relevantes, uma vez que há menos questões (ou seja, se os efeitos observados são devidos às próprias células ou à manipulação das células durante o processo de isolamento ).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores não têm reconhecimentos

Materials

Dimethyl Sulfoxide Fisher Bioreagents BP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose Sigma-Aldrich D5671
Falcon 3003 tissue culture plates Corning Corning
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 serum is batch tested to ensure it supports MSC growth
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Mr. Frosty Nalgene 5100-0001
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049
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References

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Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (154), e59419, doi:10.3791/59419 (2019).
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